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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:探索玻璃體腔注射腺相關(guān)病毒(AAV)介導(dǎo)基因人NADH脫氫酶4亞基(ND4)的劑量;評(píng)估重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的人NADH脫氫酶4亞基(rAAV-ND4)在兔眼中表達(dá)的有效性和安全性。
方法:將融合了線粒體定位序列(MitochondrialTargetingSequence,MTS)的人ND4的開(kāi)放閱讀框整合到腺相關(guān)病毒(AAV)的衣核中;構(gòu)建載體AAV-ND4;將兔子分成三個(gè)處理組。并通過(guò)玻璃體腔注射的方法分別將0.1m
2、l的AAV-ND4、0.1ml的AAV-GFP和0.1ml的PBS注射入兔眼中;通過(guò)結(jié)膜、角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜、眼壓、閃光視覺(jué)誘發(fā)電位(Flash-visualevokedpotential,F-VEP)、光學(xué)相干斷層成像(OpticalCoherenceTomography,OCT)對(duì)注射AAV-ND4基因的兔眼進(jìn)行安全性評(píng)估;通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-TimequantitativePolymeraseChainReact
3、ion,RT-PCR)、視網(wǎng)膜鋪片、免疫熒光、westernblot從mRNA和蛋白水平上對(duì)兔眼視網(wǎng)膜中ND4基因表達(dá)的檢測(cè)進(jìn)行有效性評(píng)估。
結(jié)果:在三個(gè)處理組進(jìn)行玻璃體腔注射后,沒(méi)有任何一只發(fā)生不良反應(yīng);玻璃體腔注射一個(gè)月后,三個(gè)處理組的視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的平均厚度沒(méi)有明顯差別;視覺(jué)誘發(fā)電位測(cè)試結(jié)果顯示三個(gè)處理組的P100波的潛伏期沒(méi)有明顯差別;實(shí)時(shí)定量PCR、視網(wǎng)膜鋪片、免疫熒光和westernblot顯示ND4和綠色熒光蛋
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