產(chǎn)水型NADH氧化酶與半乳糖醇脫氫酶的克隆表達與性質表征.pdf

1、NADH氧化酶能以NADH為底物，在氧氣存在的條件下生成NAD+。它可以與以NAD+為輔酶的氧化還原酶偶聯(lián)，在催化氧化還原反應的同時生成NADH，從而使輔酶能夠循環(huán)再生，提高催化反應的效率。雖然關于NADH氧化酶已有報道，但催化效率高且產(chǎn)物不含H2O2的較少。因此，制備高效NADH氧化酶具有現(xiàn)實意義。
　　本課題從變異鏈球菌（Streptococcusmutans ATCC25175）中克隆到產(chǎn)水型NADH氧化酶，并對其進行了初步

2、的生物信息學分析、表達以及酶學性質做了基本研究。
　　首先，從Pubmed中搜索并確定1種含假定存在的NADH氧化酶的菌株（變異鏈球菌Streptococcus mutans ATCC25175），并得到NADH氧化酶的主要生物學信息：目的基因SmNOX總長1374bp，共編碼457個氨基酸，產(chǎn)物分子量為49.93kDa。把SmNOX編碼的NADH氧化酶序列與數(shù)據(jù)庫中其他研究收錄的酶進行比對，結果顯示，NOX基因編碼產(chǎn)物含1個半胱

3、氨酸，為該酶的催化中心。肽鏈中含有兩個FAD結合域（FAD-binding domain1（GANHAGT），F(xiàn)AD-binding domain2（TSIPDVYAIGDCA）和一個NADH結合域（NADH-binding domain（GAGYIGVELAE））。
　　其次，對菌中的NOX基因進行了克隆表達。提取基因組后，根據(jù)DNA序列設計出兩對引物，并進行PCR得到目的片段。擴增出的SmNOX基因TA克隆于pGEM-T載體并

4、轉入大腸桿菌E.coli DH5α中。測序結果顯示，SmNOX基因序列中362位氨基酸發(fā)生了突變（F362L）。通過BamHI和XhoI限制酶分別切割pGEM-T-SmNOX與表達載體pET-28a(+)，將的基因與表達載體連接后轉化進入宿主菌BL21（DE3）。隨后誘導大腸桿菌表達，對表達產(chǎn)物以SDS-PAGE驗證。
　　然后，用Ni-NTA對SmNOX進行了純化，SDS-PAGE顯示單一條帶。隨后對SmNOX進行了酶學性質表征

5、，結果表明：在FAD濃度為30μM、pH7.0、35oC條件下，NADH氧化酶達到最大比活力202.8U/mg，反應中無需加入金屬離子，動力學常數(shù)Km、Vmax以及kcat/Km分別為247.9μM、281.7U/mg和2×106s-1M-1，在室溫下放置3h后酶活力無明顯變化。
　　接著，篩選了一種來源于類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides2.4.1 ATCC BAA-808）的短鏈脫氫酶RsGDH（Gen

6、Bank：HQ441199），該基因長780bp，編碼259個氨基酸，蛋白分子量約為26.416kDa，經(jīng)同源序列比對發(fā)現(xiàn)，該基因編碼產(chǎn)物中含有一個NAD結合域（NAD-binding（TGGTQGAG）），用以結合輔酶NAD+，且與其他半乳糖醇脫氫酶有共同的殘基Asn，Ser，Tyr，Lys，這些殘基構成了該酶的催化活性位點，因此鑒定該酶為半乳糖醇脫氫酶（RsGDH）。隨后以同樣的方式對RsGDH基因進行克隆表達，克隆后大小與已知GD

7、H序列相同，但308位堿基發(fā)生了突變（A308G）。用EcoRI和Hind III切割pGEM-T-RsGDH與pET-28a(+)后，將其轉化至BL21（DE3）進行表達， RsGDH基因產(chǎn)物以胞內(nèi)可溶蛋白和包涵體兩種形態(tài)存在。
　　最后，對RsGDH進行性質表征。結果表明：該半乳糖醇脫氫酶有廣泛的底物特異性，其中以半乳糖醇為底物時有最大酶活力。與輔酶NADP+相比，RsGDH具有更好的NAD+依賴性，且以金屬Ca2+為輔因子。