Aloferon-1抗菌肽串聯(lián)式重組表達(dá)及重組Alloferon-1生物學(xué)活性研究.pdf

1、背景和目的：惡性腫瘤是危及生命的人類重大疾病之一。目前除干擾素外,臨床上可使用的抗病毒藥物抗病毒譜較窄并可誘導(dǎo)病毒耐藥[9-10]?？咕?antibacterial-peptide)是廣泛存在于多種低等生物尤其是昆蟲體內(nèi)的短肽類物質(zhì),有抵御外界微生物侵害、清除體內(nèi)突變細(xì)胞作用的一類小分子多肽[3-7]。Alloferon-1是Chemysh等(2002)從昆蟲Calliphora vicina血液中發(fā)現(xiàn)的一種新型抗菌肽,體外試驗(yàn)結(jié)果表

2、明,Alloferon-1可使小鼠脾臟內(nèi)NK細(xì)胞活力顯著增加,并促進(jìn)干擾素(IFN)的合成與分泌。此外,針對(duì)肺部感染了致死劑量的人甲型和乙型流感病毒的小鼠,Alloferon-1可顯著地提高其存活率[1]。鑒于Alloferon-1分子量小(13肽)而難以誘生抗體、抗病毒和抗腫瘤效果明確、低劑量即能激活免疫系統(tǒng)的反應(yīng)(μg級(jí))等優(yōu)點(diǎn),故認(rèn)為Alloferon-1較之其它抗菌肽,有更為明確的應(yīng)用前景和優(yōu)勢(shì),將進(jìn)一步發(fā)展成為既抗腫瘤又抗病毒

3、的新型多肽類藥物。本研究中,我們?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)建了串聯(lián)表達(dá)14個(gè)以胰蛋白酶酶切位點(diǎn)賴氨酸連接的Alloferon-1原核表達(dá)系統(tǒng),通過對(duì)比重組表達(dá)的含賴氨酸尾巴的Alloferon-1及化學(xué)合成的Alloferon-1的體外抗腫瘤細(xì)胞活性,對(duì)重組Alloferon-1的生物學(xué)活性進(jìn)行了檢測(cè)和研究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：根據(jù)Alloferon-1氨基酸序列中不含精氨酸和賴氨酸的特點(diǎn),將串聯(lián)表達(dá)的Alloferon-1設(shè)計(jì)為用胰蛋白酶切割。先設(shè)

4、計(jì)合成一對(duì)交錯(cuò)互補(bǔ)的單鏈DNA,內(nèi)含一個(gè)Alloferon-1基因和一個(gè)賴氨酸密碼子(Alloferon-1-K基因),在此基礎(chǔ)上再利用DNA復(fù)性的原理使其聚合成不同長(zhǎng)度串聯(lián)的Alloferon-1-K雙鏈DNA。將復(fù)性后串聯(lián)的Alloferon-1-K雙鏈DNA上的缺口用T4 DNA連接酶修補(bǔ)后,再在PCR反應(yīng)體系中使串聯(lián)的Alloferon-1.K雙鏈DNA兩端的單鏈補(bǔ)齊,并在兩端連上A尾巴,然后將其克隆到T載體上;獲得的陽(yáng)性單克隆

5、菌落經(jīng)測(cè)序鑒定檢測(cè),選取插入有14×Alloferon-1-K基因T載體的單克隆并純化其中的質(zhì)粒DNA作為PCR模板,采用常規(guī)的分子生物學(xué)方法構(gòu)建生產(chǎn)14× Alloferon-1-K的原核表達(dá)系統(tǒng);采用SDS-PAGE分析14×Alloferon-1-K的表達(dá)情況和產(chǎn)量;采用Ni-NTA親和層析、胰蛋白酶酶切和Sephadex G-50層析法提純14×Alloferon-1-K及Alloferon-1-K單體;向混合有BALB/c小鼠

6、脾細(xì)胞的K562、KB和SGC腫瘤細(xì)胞中分別加入重組的Alloferon-1-K、化學(xué)合成的Alloferon-1-K及Alloferon-1,采用CCK-8法檢測(cè)對(duì)比體外抑制腫瘤細(xì)胞的活性。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了含14×Alloferon-1-K基因的原核表達(dá)系統(tǒng)pET42a-14×Alloferon-1-K E.coli BL21(DE3)。在IPTG誘導(dǎo)下,該菌株表達(dá)的重組蛋白(14×Alloferon-1-K)產(chǎn)量約為

7、細(xì)菌總蛋白的30％。獲得的重組Alloferon-1-K單體,體外抗腫瘤生物學(xué)活性分析顯示:在0.1 ng-10ng/ml的范圍內(nèi)有明顯的抑制K562、KB和SGC腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的生物學(xué)活性(P＜0.01),對(duì)照化學(xué)合成的Alloferon-1、Alloferon-1-K的抑制作用,三者間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：本研究構(gòu)建成功了含14× Alloferon-1-K基因的原核表達(dá)系統(tǒng),重組表達(dá)的Allofer