家蠅抗菌肽基因的克隆重組表達(dá)及其活性研究.pdf

1、隨著人們對(duì)抗生素的耐藥性、藥物副作用的研究越來(lái)越深入，開發(fā)新型的天然抗菌藥物成為當(dāng)前抗菌藥物的研究熱點(diǎn)?？咕淖鳛橐淮箢愋滦涂咕奶烊欢嚯目股?，能殺死耐藥菌株，且其殺菌機(jī)制使病原菌不易產(chǎn)生耐藥性突變，從而具有廣泛的應(yīng)用前景。但目前抗菌肽的來(lái)源主要為天然提取，成本相對(duì)較高。使用分子生物學(xué)方法，將目的基因轉(zhuǎn)入菌體進(jìn)行大量表達(dá)，降低純化的技術(shù)難度和成本。
　　本文重點(diǎn)研究家蠅抗菌肽基因Md-Cec在大腸桿菌中的表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分

2、離純化和活性檢測(cè)。以家蠅(Muscadomestica)蛹的總RNA為模板，通過RT-PCR方法獲得家蠅抗菌肽基因Md-Cec，目的基因插入質(zhì)粒pMAL-c2x重組后轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過提取和純化誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，得到了純品。最后初步測(cè)定純化蛋白的抑菌活性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:以家蠅蛹總RNA為模板，RT-PCR得到了家蠅抗菌肽基因Md-Cec，成功構(gòu)建了克隆載體pMAL-Md-Cec，且Md-Cec基因測(cè)序結(jié)果與Geneb

3、ank一致。根據(jù)家蠅抗菌肽核酸序列和編碼的氨基酸序列對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)。構(gòu)建的重組載體pMAL-Md-Cec最終選擇BL21(DE3)PlysS為最適表達(dá)菌株，IPTG濃度0.5mM，誘導(dǎo)時(shí)間4小時(shí)為最佳誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)后表達(dá)量較高。表達(dá)菌體破碎提取經(jīng)直鏈淀粉樹脂柱純化，得到純度較高且濃度較高的表達(dá)蛋白(對(duì)照蛋白pMAL(P)的含量為:7.565mg/mL重組蛋白;pMAL-Cec(A)的含量為:6.170mg/mL)