Polyhedrin作為融合伴侶用于制備重組抗菌肽的研究.pdf

1、抗菌肽(Antimicrobialpeptide,AMP)是具有抗菌活性的一類短肽，其水溶性好，熱穩(wěn)定性高，能適應(yīng)較大的pH變化或較高離子強(qiáng)度；AMP合成速度快，因分子小而易擴(kuò)散，對(duì)正常真核細(xì)胞幾乎沒(méi)有損害；AMP除有廣譜的抗菌活性外，還具有抗原蟲(chóng)、病毒及腫瘤細(xì)胞等廣泛的生物活性。與傳統(tǒng)抗生素不同的是，其殺細(xì)胞機(jī)制是在靶細(xì)胞膜上形成穿孔，細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性，因而最有希望成為“傳統(tǒng)抗菌素”的替代品。AMP走向臨床的一大挑戰(zhàn)是如何低成本大量

2、生產(chǎn)。雖然有許多關(guān)于AMP原核表達(dá)成功的報(bào)道，但這些方法仍然受制于純化過(guò)程復(fù)雜、AMP酶降解及產(chǎn)出率低等問(wèn)題而未能工業(yè)化。多角體蛋白(Polyhedrin，Polh)是昆蟲(chóng)桿狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在外界極其穩(wěn)定，能保護(hù)病毒，且包涵體表達(dá)之重組多角體蛋白具有與天然蛋白質(zhì)相同的特性。本研究的目的就是用來(lái)源于苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒的Polh作為融合伴侶，利用其穩(wěn)定性及保護(hù)特性，建立一種新的低成本大量生產(chǎn)AMP的原核表達(dá)及純化系統(tǒng)，促使AM

3、P早日實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，成為商品藥物。 方法：構(gòu)建pMPL102原核表達(dá)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，以包涵體形式表達(dá)重組融合蛋白Polh-GFP，對(duì)重組融合蛋白包涵體進(jìn)行初步純化，經(jīng)昆蟲(chóng)腸道堿性蛋白酶或α-糜蛋白酶消化Polh，得到重組GFP產(chǎn)品。對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行SDS-PAGE及Western-blot分析。構(gòu)建pTrcGFPuv原核表達(dá)重組質(zhì)粒，僅表達(dá)GFP單體，與pMPL102進(jìn)行對(duì)比表達(dá)，檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)密度，熒光密度

4、及GFP表達(dá)量。構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pPAP，表達(dá)重組融合蛋白Polh-Hal18，對(duì)重組融合蛋白進(jìn)行Ni-NTA金屬離子親和層析純化，經(jīng)羥胺剪切、透析、離心分離，回收抗菌肽Hal18并進(jìn)行RP-HPLC純化；對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Tricine-PAGE、Western-blot分析，純化后Hal18作質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，并測(cè)定其抗菌活性。 結(jié)果：融合蛋白Polh-GFP(分子量約58kDa)以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的30％，

5、與表達(dá)單體可溶性GFP的菌株對(duì)比，表達(dá)Polh-GFP融合蛋白的菌株呈現(xiàn)較高的生長(zhǎng)密度(約1.8倍)和GFP產(chǎn)出(約3.5倍)，且Polh-GFP融合蛋白顯示出與天然多角體蛋白相似的特性，即快速溶于類似于昆蟲(chóng)中腸內(nèi)的堿性pH條件。Polh能被小菜蛾中腸堿性蛋白酶或α-糜蛋白酶降解，融合蛋白中的GFP以及酶消化融合蛋白后得到的GFP仍然維持部分生物活性(發(fā)熒光)。融合蛋白Polh-Hal18(分子量約33.6kDa)也以包涵體形式表達(dá)。包

6、涵體不僅提高了表達(dá)水平(Polh-Hal18表達(dá)水平可高達(dá)細(xì)菌總蛋白之50％)，且容易純化；金屬離子親和層析純化后得到純度86％的產(chǎn)品，產(chǎn)品無(wú)抗菌活性；經(jīng)過(guò)羥胺剪切，中性pH條件透析后離心(Polh不溶于該pH條件)，成功分離Polh與Hal18，所得到的Hal18(分子量約2kDa)粗制品純度約25％，有抗菌活性；經(jīng)RP-HPLC純化后得到純度＞90％的Hal18，最終回收率近30％。純化之Hal18顯示與化學(xué)合成之Hal18相同的抗

7、G+代表株金黃色葡萄球菌及G-代表株大腸桿菌的抗菌活性。 結(jié)論：Polyheldrin是一個(gè)比較理想的融合伴侶，它能促進(jìn)宿主菌生長(zhǎng)，還能大大簡(jiǎn)化純化步驟，提高蛋白回收率；Polyheldrin以包涵體的形式在E.coli中表達(dá)，但與其同時(shí)表達(dá)的GFP仍然維持部分生物活性(發(fā)熒光)。Polh作為融合伴侶能高水平表達(dá)出有抗菌活性之抗菌肽Hal18，且能避免融合蛋白被酶降解，還因純化步驟簡(jiǎn)單而達(dá)到較高的產(chǎn)品回收率。大于抗菌肽分子10倍

8、以上的融合伴侶Polh可以使融合蛋白獲得高水平表達(dá)，此時(shí)融合蛋白中的抗菌肽因構(gòu)像改變暫時(shí)失去生物活性。羥胺剪切經(jīng)濟(jì)、低毒且不影響抗菌肽活性，是不錯(cuò)的選擇。本抗菌肽融合表達(dá)系統(tǒng)具有純化過(guò)程簡(jiǎn)單、產(chǎn)品回收率高之特點(diǎn)，易于自動(dòng)化及標(biāo)準(zhǔn)化，將極大地促進(jìn)抗菌肽的功能研究，可用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。 創(chuàng)新點(diǎn)：①首次應(yīng)用Polyheldrin為融合伴侶表達(dá)GFP及AMP，利用多角體蛋白的穩(wěn)定及保護(hù)特性，使融合蛋白以包涵體形式高水平表達(dá)于大腸桿菌；②利