單純性馬蹄內(nèi)翻足與COL1A1基因的相關(guān)性研究.pdf

1、單純性馬蹄內(nèi)翻足(idiopathic congenital talipes equinovar，ICTEV)是一種出生時(shí)即可見(jiàn)的復(fù)雜的先天性足畸形。在不同的人群中，ICTEV的發(fā)病率有很大差異，在我國(guó)約為0.6‰～1‰，男女之比約為2～2.5:1。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于ICTEV的發(fā)病機(jī)制爭(zhēng)論較多，但均缺乏有力的證據(jù)。臨床資料和流行病學(xué)研究表明，遺傳因素在ICTEV的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，但其遺傳方式、外顯率等均不清楚。目前認(rèn)為ICT

2、EV主要是在肢芽發(fā)育的易損期，由于遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用，某些與肢體發(fā)育有關(guān)的基因及其產(chǎn)物出現(xiàn)異常的結(jié)果。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)ICTEV致病基因的分子水平上的研究很少，研究多集中于對(duì)一些合并有類(lèi)似足部畸形的綜合征和多發(fā)畸形的研究。這些研究提供了ICTEV致病基因可能的侯選區(qū)域：5q15-31.1；6q12-13；7號(hào)染色體長(zhǎng)臂；17號(hào)染色體長(zhǎng)臂；10p11.2-15；9號(hào)染色體中心粒周?chē)鷧^(qū)等，通過(guò)生物信息學(xué)可知這些區(qū)域內(nèi)存在著一些與骨

3、骼、肌肉、肌腱、神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因，這為本研究探尋ICTEV的易感基因提供了有利的線索。 目前的研究表明，在ICTEV患側(cè)組織中存在纖維組織明顯增加，其中Ⅰ型膠原增加最顯著。Ⅰ型膠原是由兩條α1鏈及一條α2鏈組成的三股螺旋結(jié)構(gòu)。Ⅰ型膠原的α1鏈和α2鏈分別由COL1A1和COL1A2基因編碼。COL1A1基因和COL1A2基因分別位于17q21.3-q22和7q21.3-q22。目前已發(fā)現(xiàn)上百種COL1A1基因突變，主要集中在外

4、顯子。COL1A1基因突變可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，主要可引起先天性成骨不全、Ehlers Dahlos綜合征(EDS)、骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis)。但是對(duì)于COL1A1基因與ICTEV相關(guān)性的進(jìn)一步研究至今仍未見(jiàn)報(bào)道。本研究以COL1A1基因?yàn)楹蜻x基因，將從分子水平上進(jìn)一步探討I型膠原基因與ICTEV發(fā)生的相關(guān)性。 為了從RNA水平上進(jìn)一步觀察ICTEV中的COL1A1基因表達(dá)水平的變化，本研究中我們首先構(gòu)建了馬蹄內(nèi)翻

5、足大鼠模型，并采用半定量RT-PCR的方法，對(duì)后肢發(fā)育不同時(shí)期的模型胎鼠和正常胎鼠后肢組織中Collal基因的表達(dá)水平進(jìn)行了比較。接下來(lái)，我們又采用半定量RT-PCR方法，對(duì)20例ICTEV患兒和4例正常兒童的肌肉和肌腱組織中COL1A1基因的表達(dá)水平進(jìn)行了比較。此外，為了探討COL1A1基因表達(dá)水平變化的原因，本研究選擇了COL1A1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1031bp～+30bp和第1內(nèi)含子，對(duì)84例ICTEV患者進(jìn)行了突變篩查。

6、 材料與方法 一、研究對(duì)象： Wistar大鼠86只，包括雌鼠65只和雄鼠21只，均購(gòu)自校動(dòng)物部。 肌肉及肌腱標(biāo)本來(lái)自于20例手術(shù)矯正的ICTEV患兒，取4例外傷及尸檢患兒相應(yīng)組織作為正常對(duì)照，所有標(biāo)本均經(jīng)患者知情同意。 84例單純性馬蹄內(nèi)翻足患者的靜脈抗凝血，標(biāo)本由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院小兒外科提供。其中男性60例，女性24例(男女之比為2.5：1)；年齡最大者28歲，最小者4個(gè)月；單側(cè)馬蹄內(nèi)翻足者

7、51例，雙側(cè)馬蹄內(nèi)翻足者33例(雙側(cè)者占39.28％)；所有患者均具有典型的臨床癥狀，經(jīng)X線和手術(shù)確診。100例正常人DNA，研究對(duì)象均來(lái)自中國(guó)東北地區(qū)正常漢族人群。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、大鼠模型的構(gòu)建及半定量RT-PCR檢測(cè)模型鼠后肢Collal基因的表達(dá) (1)構(gòu)建大鼠模型通過(guò)在孕十天給孕鼠灌全反式維甲酸(135mg/kg體重)和礦物油分別獲得馬蹄內(nèi)翻足模型胎鼠及正常對(duì)照胎鼠。 (2)觀察Collal基

8、因在動(dòng)物模型中的表達(dá)情況分別取孕15天，17天，19天及21天的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組胎鼠的后肢，常規(guī)提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以β-actin為內(nèi)對(duì)照采用半定量RT-PCR方法研究Collal基因在后肢發(fā)育不同階段的表達(dá)情況。 2．半定量RT-PCR分析COL1A1基因在患兒及正常對(duì)照肌肉、肌腱組織中的表達(dá) (1)按常規(guī)方法提取患兒及正常對(duì)照肌肉、肌腱組織中的總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。 (2)以β

9、-actin為內(nèi)對(duì)照采用半定量RT-PCR方法研究COL1A1基因在患兒及正常對(duì)照肌肉、肌腱組織中的表達(dá)情況。 3．PCR-DGGE (1)PCR擴(kuò)增明確COL1A1基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和第1內(nèi)含子的基因序列，并應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物(上海生工合成)，在上游引物的5′端加上40bp的[GC]夾。對(duì)84名單純性馬蹄內(nèi)翻足患者DNA目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 (2)DGGE檢測(cè)以

10、變性劑濃度范圍為20％-80％的聚丙烯酰胺凝膠做水平DGGE，并根據(jù)帶形及其位置進(jìn)一步調(diào)節(jié)變性劑濃度范圍及電泳時(shí)間；電泳后，下膠，溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察結(jié)果。 (3)確定突變位點(diǎn)對(duì)電泳帶形異常的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序以確定序列改變的位置與性質(zhì)，并對(duì)正常人DNA的相同位點(diǎn)進(jìn)行篩查，以判斷該堿基置換是突變還是多態(tài)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、模型胎鼠RT-PCR結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示在模型胎鼠后肢發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均存在C

11、ollal基因表達(dá)的上調(diào)。 二、人COL1A1基因RT-PCR結(jié)果ICTEV患兒肌肉及肌腱組織中COL1A1基因表達(dá)水平高于正常組織。 三、PCR-DGGE檢測(cè)結(jié)果經(jīng)DGGE篩查并測(cè)序發(fā)現(xiàn)一名患者-161bp處存在C→T的雜合突變，另一名患者+274bp處存在C→G的純合突變。分別經(jīng)過(guò)對(duì)100名正常人的同一位點(diǎn)進(jìn)行篩查，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相同的改變，排除其為多態(tài)。經(jīng)查找人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(TheHuman Gene Mutatio

12、n Database，HGMD)，證實(shí)是尚未見(jiàn)報(bào)道的新突變。 結(jié)論 1、應(yīng)用半定量RT-PCR的方法發(fā)現(xiàn)在馬蹄內(nèi)翻足模型胎鼠后肢發(fā)育的不同時(shí)期均存在Collal基因表達(dá)的上調(diào)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)單純性馬蹄內(nèi)翻足患兒患側(cè)肌肉及肌腱組織中COL1A1基因表達(dá)水平高于正常組織，證明了該基因與馬蹄內(nèi)翻足畸形的發(fā)生具有相關(guān)性。 2、在COL1A1基因-161bp處和+274bp處發(fā)現(xiàn)了新突變，提示該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的突變可能是ICT