GLI3基因與單純性馬蹄內(nèi)翻足的相關(guān)性研究及其作用機(jī)制探討.pdf

1、前言
　　 單純性馬蹄內(nèi)翻足(Idiopathic congenital talipes equinovarus,ICTEV)是常見的嚴(yán)重危害兒童健康的先天畸形之一,發(fā)病率為1～8‰。遺傳因素在ICTEV的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用,遺傳度為65％。但其遺傳方式、外顯率等均不清楚,易感基因尚未確定。目前研究較多的與ICTEV發(fā)病相關(guān)的基因主要集中在與足踝部的骨骼、軟骨、肌肉和神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因,如COL9A1,CASP10,WNT7

2、A,HOXD13,GLI3等。本課題組前期應(yīng)用SNP關(guān)聯(lián)分析的方法對(duì)84個(gè)ICTEV核心家系GLI3基因內(nèi)的2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分析,提示GLI3基因可能是單純性馬蹄內(nèi)翻足的易感基因。GLI基因家族是一個(gè)高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族,其中的GLI3是極化活性區(qū)內(nèi)的信號(hào)分子之一,它可以沿肢體前后軸方向限定各個(gè)基因表達(dá)的區(qū)域邊界,這為建立肢體不對(duì)稱模式提供了必要的位置信息。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)GLI3基因的研究主要集中于它與指(趾)的發(fā)育畸形相關(guān),其突變可以

3、導(dǎo)致多種與指(趾)畸形相關(guān)的疾病,但GLI3基因是否與ICTEV的發(fā)病相關(guān)還未見報(bào)道。另有報(bào)道HOXD13基因與ICTEV的發(fā)生密切相關(guān),本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討GLI3基因與ICTEV的相關(guān)性,以及在ICTEV發(fā)生過程中HOXD13基因如何調(diào)控GLI3基因的機(jī)制。
　　 方法
　　 標(biāo)本:84例ICTEV患者外周靜脈血和15例ICTEV患者肌肉組織標(biāo)本由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒外科提供,9例同年齡組的正常人足部肌肉組織及肺

4、組織由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院提供。所有標(biāo)本使用均經(jīng)患者知情同意。成年Wistar大鼠購自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,所有的實(shí)驗(yàn)過程都遵照動(dòng)物保護(hù)條例。
　　 1、變性梯度凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)GLI3基因編碼區(qū)的突變
　　 PCR擴(kuò)增84例患者GLI3基因10個(gè)外顯子(另外4個(gè)外顯子基因突變篩查工作前期已經(jīng)完成),應(yīng)用20％～80％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳篩查10個(gè)外顯子的突變情況。
　　 2、RT-PCR方法研究GLI3

5、基因在ICTEV患者下肢表達(dá)情況。
　　 分別提取ICTEV患者及正常人下肢足踝部拇長(zhǎng)屈肌、正常人肺組織的總RNA,應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)GLI3基因的表達(dá)。
　　 3、構(gòu)建ICTEV大鼠模型
　　 Wistar大鼠于孕10天全反式維甲酸灌胃給藥(劑量:135mg/kg體重)。
　　 4、Real Time PCR、免疫組織化學(xué)染色和Western Blotting方法研究Gli3基因在ICTEV模型鼠

6、下肢肌肉組織中的表達(dá)
　　 分別提取ICTEV模型胎鼠及正常對(duì)照胎鼠下肢肌肉組織的總RNA,應(yīng)用RealTime PCR檢測(cè)Gli3基因的表達(dá)情況；分別提取ICTEV模型胎鼠及正常對(duì)照胎鼠下肢肌肉組織的蛋白質(zhì),應(yīng)用Western Blotting檢測(cè)Gli3蛋白的表達(dá)情況；分別取ICTEV模型胎鼠及正常對(duì)照胎鼠下肢,甲醛固定,石蠟包埋,按照免疫組化試劑盒操作說明檢測(cè)Gli3蛋白表達(dá)情況。
　　 5、應(yīng)用P-Match軟件

7、預(yù)測(cè)大鼠Gli3基因5'上游序列轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)
　　 獲取大鼠Gli3基因上游1100bp 5’側(cè)翼序列信息(http://www.ensembl.org),應(yīng)用P-Match軟件預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 6、熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)
　　 PCR擴(kuò)增大鼠Gli3基因啟動(dòng)子區(qū)域依次截短的啟動(dòng)子序列,構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3-Gli3。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠L6細(xì)胞,觀察大鼠Gli3基因啟動(dòng)子區(qū)域活性。

8、r>　　 7、染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)
　　 將孕14天胎鼠下肢肢芽直接勻漿處理,甲醛交聯(lián)、酶切后應(yīng)用Gli3抗體進(jìn)行沉淀,沉淀下來DNA通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。
　　 8、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)
　　 孕14天胎鼠下肢肢芽組織核蛋白和3’生物素標(biāo)記的探針(含有位點(diǎn)2)在凝膠阻滯緩沖液中室溫結(jié)合1小時(shí),10％聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜、紫外交聯(lián)后,應(yīng)用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果。
　　 9、RNAi

9、使Hoxd13基因表達(dá)下調(diào),觀察Gli3基因的表達(dá)情況
　　 化學(xué)合成Hoxd13基因的siRNA,轉(zhuǎn)染大鼠L6細(xì)胞后,通過Real Time PCR的方法觀察Gli3基因表達(dá)水平的改變。
　　 10、在大鼠L6細(xì)胞系中外源表達(dá)Hoxd13后觀察Gli3基因表達(dá)
　　 構(gòu)建Hoxd13的真核細(xì)胞表達(dá)載體PIRES2-EGFP-Hoxd13,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠L6細(xì)胞后,通過Real Time PCR的方法觀察Gli3基

10、因表達(dá)水平的改變。
　　 結(jié)果
　　 1、在84例ICTEV患者外周靜脈血中未發(fā)現(xiàn)GLI3基因外顯子1～8、外顯子13存在突變。
　　 2、在ICTEV患者及正常人下肢拇長(zhǎng)屈肌中都未檢測(cè)到GLI3基因的表達(dá)。
　　 3、不論在mRNA水平,還是在蛋白質(zhì)水平,Gli3基因在ICTEV模型胎鼠下肢組織中的表達(dá)都要明顯高于正常對(duì)照胎鼠。
　　 4、大鼠Gli3基因5’側(cè)翼序列啟動(dòng)子區(qū)域存在不同的調(diào)控因子

11、,利用P-Match軟件預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)2個(gè)Hoxd13的可能結(jié)合位點(diǎn),分別命名為Hoxd13結(jié)合位點(diǎn)1(-667～-663)和Hoxd13結(jié)合位點(diǎn)2(-477～-473)。
　　 5、在大鼠胚胎肢體發(fā)育過程中Hoxd13可以和Gli3基因啟動(dòng)子區(qū)Hoxd13結(jié)合位點(diǎn)2直接結(jié)合。
　　 應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)驗(yàn)證在體內(nèi)Hoxd13和Gli3基因上游序列的結(jié)合作用。以孕14天的大鼠胎鼠下肢肢芽組織為研究材料進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)

12、驗(yàn),實(shí)驗(yàn)證實(shí)反膠聯(lián)后提取的DNA上僅有Hoxd13結(jié)合位點(diǎn)2的擴(kuò)增,無Hoxd13結(jié)合位點(diǎn)1的擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在大鼠胚胎肢體發(fā)育過程中Hoxd13蛋白可以和Gli3啟動(dòng)子區(qū)的Hoxd13結(jié)合位點(diǎn)2結(jié)合發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。
　　 6、在體外Hoxd13蛋白可以和Gli3基因啟動(dòng)子區(qū)位點(diǎn)2直接結(jié)合。
　　 EMSA結(jié)果表明,當(dāng)Hoxd13蛋白質(zhì)存在時(shí)出現(xiàn)阻滯的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體,當(dāng)加入Hoxd13抗體時(shí)出現(xiàn)超阻滯條帶。證

13、明在體外Hoxd13和預(yù)測(cè)的Hoxd13結(jié)合位點(diǎn)2可以直接結(jié)合。
　　 7、RNAi方法干擾HoxD13基因表達(dá)后,Gli3基因表達(dá)情況。
　　 將吉瑪公司設(shè)計(jì)的三個(gè)Hoxd13基因的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠L6細(xì)胞系中,發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)siRNA能使Hoxd13表達(dá)下調(diào),同時(shí)檢測(cè)到該標(biāo)本中Gli3基因表達(dá)明顯上調(diào),說明Hoxd13很可能是Gli3基因的負(fù)調(diào)控因子。
　　 8、大鼠L6細(xì)胞系中外源過量表達(dá)Hoxd13后

14、Gli3基因的表達(dá)情況。
　　 將Hoxd13的真核細(xì)胞表達(dá)載體PIRES2-EGFP-Hoxd13瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠L6細(xì)胞后,通過Real Time PCR的方法觀察到Hoxd13基因的表達(dá)水平明顯上調(diào),同時(shí)Gli3基因表達(dá)水平下調(diào)。
　　 結(jié)論
　　 1、GLI3基因的編碼區(qū)突變可能不是ICTEV發(fā)病的因?yàn)椤?br>　　 2、HOXD13基因的表達(dá)下調(diào)并導(dǎo)致GLI3基因的表達(dá)上調(diào)可能與ICTEV畸形的發(fā)生有關(guān)。