SOX9與單純性馬蹄內(nèi)翻足相關(guān)性研究及其作用機(jī)制探討.pdf

1、單純性馬蹄內(nèi)翻足(Idiopathic congenital talipes equinovarus，ICTEV)是常見(jiàn)的嚴(yán)重危害兒童健康的先天畸形之一，發(fā)病率在1～8‰。遺傳因素在ICTEV的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其遺傳度為65％。但其遺傳方式、外顯率等均不清楚，易感基因尚未確定。目前研究較多的與ICTEV發(fā)病相關(guān)的基因主要集中在與足踝部骨骼、軟骨、肌肉和神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因，如COL9A1，CASP10，WNT7A，HOXD13，G

2、LI3等。我們課題組前期應(yīng)用ETDT方法對(duì)84例ICTEV核心家系Collagen typeⅨ，alphal(COL9A1)基因簇內(nèi)的7個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分析，提示COL9A1基因可能是ICTEV的易感基因。通過(guò)對(duì)25例ICTEV患兒肌肉及肌腱組織COL9A1基因mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示患兒COL9A1表達(dá)明顯增加。用PCR-SSCP方法進(jìn)行COL9A1基因近端啟動(dòng)子突變篩查，亦沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變。之后我們分別構(gòu)建了COL9

3、A1基因近端啟動(dòng)子系列截短熒光素酶報(bào)告基因載體，轉(zhuǎn)染Bel細(xì)胞系、823細(xì)胞系、人成纖維細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染結(jié)果提示：COL9A1基因上游-559到-403之間、-275到-195之間可能存在著正調(diào)控元件。接著缺失型及突變型熒光素酶表達(dá)載體熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果提示：COL9A1基因近端啟動(dòng)子的-257至-275之間可能是COL9A1基因的正調(diào)控元件，又應(yīng)用P-MATCH軟件預(yù)測(cè)此區(qū)域有轉(zhuǎn)錄因子SRY-related high mobility

4、group box gene9(SOX9)的結(jié)合位點(diǎn)。
　　 SOX9基因是SOX基因家族中重要的一員，作為轉(zhuǎn)錄因子，其在脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，尤其在人和哺乳動(dòng)物性別決定和軟骨生成中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。人的SOX9基因定位于17q23，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)4.3kb，編碼含509個(gè)氨基酸分子量為56kDa的蛋白。1994年，SOX9作為軀干發(fā)育異常(Camptomelicdysplasia CD)致病基因被鑒定出來(lái)。如果

5、SOX9發(fā)生突變或SOX9基因的單倍體不足就可以導(dǎo)致CD。CD是一種罕見(jiàn)的先天性軟骨發(fā)育異常綜合癥(國(guó)外報(bào)道發(fā)病率為0.5～1/10萬(wàn))，表現(xiàn)為骨骼發(fā)育障礙伴隨XY性別逆轉(zhuǎn)，屬常染色體顯性遺傳病。SOX9在骨和軟骨發(fā)育中起關(guān)鍵作用。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證明：在人軟骨細(xì)胞中，SOX9能以轉(zhuǎn)錄因子形式結(jié)合COL2A1、COL9A1、COL27A1或軟骨基質(zhì)蛋白-1基因(Matrilin-1)等基因上游相應(yīng)SOX9結(jié)合位點(diǎn)，從而來(lái)調(diào)控其基因的表達(dá)，這

6、種結(jié)合是通過(guò)位于SOX9蛋白N端附近二聚體域介導(dǎo)的，而不是HMG域。此區(qū)域突變降低了它們的結(jié)合力從而導(dǎo)致CD。
　　 本研究旨在探索SOX9基因是否與ICTEV畸形發(fā)生相關(guān)，SOX9蛋白能否與COL9A1上游預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，以及在ICTEV發(fā)生過(guò)程中SOX9基因是否受其它基因的調(diào)控。
　　 方法：
　　 標(biāo)本：84例ICTEV患者外周靜脈血和15例ICTEV患者足踝部肌肉組織(主要為()長(zhǎng)屈肌)標(biāo)本由中國(guó)醫(yī)科

7、大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)院小兒外科提供，9例同齡正常對(duì)照(非ICTEV患者)足踝部肌肉組織(主要為()長(zhǎng)屈肌)由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院提供。2例踝關(guān)節(jié)開(kāi)放型外傷患者清創(chuàng)剔除的部分肌肉及軟骨組織由沈陽(yáng)市奉天醫(yī)院骨外科提供。所有標(biāo)本使用均經(jīng)患者知情并同意。
　　 1、用變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)檢測(cè)SOX9基因外顯子及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1100bp序列突變
　　 PCR擴(kuò)增84例患者SOX9基因2個(gè)外顯子以及SOX9基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)

8、上游1100bp序列，應(yīng)用20%～80%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳篩查上述片段突變情況。
　　 2、分別用RT-PCR、real-time RT-PCR方法、免疫組織化學(xué)染色和Western-Blotting方法在mRNA及蛋白表達(dá)水平上研究SOX9基因在ICTEV患者足踝部肌肉表達(dá)情況
　　 分別提取ICTEV患者及對(duì)照足踝部肌肉組織的RNA，應(yīng)用RT-PCR及real-time RT-PCR方法檢測(cè)SOX9基因mRNA

9、的表達(dá)。制作ICTEV患者及對(duì)照足踝部肌肉組織切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，觀察SOX9蛋白的表達(dá)部位；分別提取ICTEV患者及對(duì)照足踝部肌肉組織總蛋白，應(yīng)用Western-Blotting檢測(cè)SOX9蛋白的表達(dá)情況。
　　 3、用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察SOX9與COL9A1蛋白在ICTEV患者足踝部肌肉組織的表達(dá)
　　 制作ICTEV患者及對(duì)照足踝部肌肉組織冰凍切片，經(jīng)常規(guī)處理后用SOX9兔多克隆抗體及COL9A1

10、鼠多克隆抗體共雜交，用FITC標(biāo)記羊抗兔熒光二抗及TRITC標(biāo)記羊抗鼠熒光二抗雜相應(yīng)抗體，應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡同時(shí)觀察SOX9蛋白及COL9A1蛋白的表達(dá)部位。
　　 4、用染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)在體內(nèi)驗(yàn)證SOX9蛋白與COL9A1基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)SOX9結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合作用
　　 將踝關(guān)節(jié)外傷患者清創(chuàng)剔除的肌肉及軟骨組織分別直接勻漿處理，甲醛交聯(lián)、酶切后應(yīng)用SOX9抗體進(jìn)行沉淀，沉淀下來(lái)DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)

11、結(jié)果。
　　 5、用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)在體外驗(yàn)證SOX9蛋白與COL9A1基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)SOX9結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合作用
　　 將踝關(guān)節(jié)外傷患者清創(chuàng)剔除的肌肉和軟骨組織核蛋白分別和3’生物素標(biāo)記的COL9A1基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)SOX9結(jié)合位點(diǎn)探針，在凝膠阻滯緩沖液中室溫結(jié)合1小時(shí)，10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、紫外交聯(lián)后，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果。
　　 6、用P-Match軟件預(yù)測(cè)人SOX9基因5’上游序

12、列轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)
　　 獲取人SOX9基因上游1200bp5’側(cè)翼序列信息(http：//www.ensembl.org)，應(yīng)用P-Match軟件預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 7、用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)SOX9基因啟動(dòng)子系列截短熒光素酶表達(dá)載體熒光素酶活性
　　 PCR擴(kuò)增人SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)域依次截短的啟動(dòng)子序列，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3-SOX9。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人RD細(xì)胞，觀察各載體熒光素酶

13、活性。
　　 8、用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)SOX9基因啟動(dòng)子系列截短熒光素酶表達(dá)載體與結(jié)合位點(diǎn)突變熒光素酶表達(dá)載體熒光素酶活性
　　 為了檢測(cè)上述3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)在相應(yīng)調(diào)控區(qū)的作用，我們將構(gòu)建的SOX9基因啟動(dòng)子系列截短熒光素酶表達(dá)載體與結(jié)合位點(diǎn)突變熒光素酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，觀察各載體熒光素酶活性。
　　 9、用染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)在體內(nèi)驗(yàn)證HOXD13與SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)HOXD13結(jié)合位點(diǎn)結(jié)

14、合作用
　　 將踝關(guān)節(jié)外傷患者清創(chuàng)剔除的肌肉組織直接勻漿處理，甲醛交聯(lián)、酶切后應(yīng)用HOXD13抗體進(jìn)行沉淀，沉淀下來(lái)DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。
　　 10、用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)在體外驗(yàn)證HOXD13與SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)HOXD13結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合作用
　　 踝關(guān)節(jié)外傷患者清創(chuàng)剔除的肌肉組織核蛋白和3’生物素標(biāo)記的SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)HOXD13結(jié)合位點(diǎn)探針(含有位點(diǎn)3)在凝膠阻滯緩沖液中室溫結(jié)合1

15、小時(shí)，10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、紫外交聯(lián)后，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果。
　　 11、用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)HOXD13低表達(dá)時(shí)Luc-3P及Luc-3M熒光素酶表達(dá)載體熒光素酶活性
　　 化學(xué)合成HOXD13基因的siRNA與Luc-3P或Luc-3M共轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，然后按雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定。
　　 12、用Real-time RT-PCR方法觀

16、察HOXD13基因表達(dá)下調(diào)時(shí)，SOX9及COL9A1基因的mRNA表達(dá)水平改變
　　 化學(xué)合成HOXD13基因的siRNA，轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞后，通過(guò)Real-time RT-PCR的方法檢測(cè)SOX9及COL9A1基因mRNA表達(dá)水平的改變。
　　 結(jié)果：
　　 1、在84例ICTEV患者外周靜脈血中未發(fā)現(xiàn)SOX9基因1、2外顯子及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1100bp范圍內(nèi)存在突變。
　　 2、不論在mRNA水平，還是在

17、蛋白水平，ICTEV患者足踝部肌肉組織中存在(12/15，80%)SOX9基因表達(dá)上調(diào)并且患者在mnRNA表達(dá)水平升高的與在蛋白表達(dá)升高的相一致。
　　 3、激光掃描共聚焦顯微鏡顯示SOX9與COL9A1在ICTEV患者足踝部肌肉組織同時(shí)存在于肌膜、肌內(nèi)膜、肌外膜的結(jié)締組織中且二者位置重合，提示二者可能在ICTEV患者足踝部肌肉組織中存在某種關(guān)系。
　　 4、ChIP實(shí)驗(yàn)顯示在肌肉及軟骨組織中SOX9蛋白均可以和COL9

18、A1基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)SOX9結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合。
　　 5、EMSA實(shí)驗(yàn)顯示在體外SOX9蛋白可以和COL9A1基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)SOX9結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合。
　　 EMSA結(jié)果表明當(dāng)肌肉及軟骨核蛋白存在時(shí)出現(xiàn)阻滯的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，當(dāng)加入SOX9抗體時(shí)出現(xiàn)超阻滯條帶。證明在體外SOX9和COL9A1基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)的SOX9結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合。
　　 6、人SOX9基因5’側(cè)翼序列啟動(dòng)子區(qū)域存在不同的調(diào)控因子，利用

19、P-Match軟件預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)3個(gè)HOXD13的可能結(jié)合位點(diǎn)，分別命名為HOXD13結(jié)合位點(diǎn)1、HOXD13結(jié)合位點(diǎn)2和HOXD13結(jié)合位點(diǎn)3。
　　 7、將以SOX9基因5’側(cè)翼序列1200bp內(nèi)預(yù)測(cè)的3個(gè)HOXD13結(jié)合位點(diǎn)的位置設(shè)計(jì)5個(gè)截短熒光素酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞后，各載體熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果
　　 實(shí)驗(yàn)顯示在SOX9基因5’上游-1158bp至-770bp之間(即含有HOXD13結(jié)合位點(diǎn)1)區(qū)域存在負(fù)調(diào)控區(qū)；在

20、SOX9基因5’上游-770bp至-512bp之間(即含有HOXD13結(jié)合位點(diǎn)2)區(qū)域存在正調(diào)控區(qū)；在SOX9基因5’上游-512bp至-368bp之間(即含有HOXD13結(jié)合位點(diǎn)3)區(qū)域存在負(fù)調(diào)控區(qū)。
　　 8、SOX9基因啟動(dòng)子系列截短熒光素酶表達(dá)載體與結(jié)合位點(diǎn)突變熒光素酶表達(dá)載體熒光素酶活性的比較結(jié)果
　　 為了檢測(cè)上述3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)在相應(yīng)調(diào)控區(qū)的作用，我們將構(gòu)建SOX9基因啟動(dòng)子系列截短熒光素酶表達(dá)載體與結(jié)合位點(diǎn)突

21、變熒光素酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，結(jié)果在RD細(xì)胞系中Luc-1M(結(jié)合位點(diǎn)1核心序列突變)與Luc-1P相比啟動(dòng)子活性升高了0.4倍；Luc-2M(結(jié)合位點(diǎn)2核心序列突變)與Luc-2P相比啟動(dòng)子活性下降了0.4倍；Luc-3M(結(jié)合位點(diǎn)3核心序列突變)與Luc-3P相比啟動(dòng)子活性升高了3.2倍。說(shuō)明位點(diǎn)1、3起負(fù)調(diào)控作用，而位點(diǎn)2起正調(diào)控作用。
　　 9、ChIP結(jié)果顯示在肌肉組織內(nèi)HOXD13蛋白可以和SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)

22、的3個(gè)HOXD13結(jié)合位點(diǎn)中位點(diǎn)3直接結(jié)合。
　　 10、EMSA結(jié)果顯示在體外HOXD13蛋白可以和SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)HOXD13結(jié)合位點(diǎn)3直接結(jié)合。
　　 EMSA結(jié)果表明當(dāng)肌肉核蛋白存在時(shí)出現(xiàn)阻滯的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，當(dāng)加入HOXD13抗體時(shí)出現(xiàn)超阻滯條帶，證明在體外HOXD13和SOX9基因上游預(yù)測(cè)的HOXD13結(jié)合位點(diǎn)3直接結(jié)合。
　　 11、HOXD13低表達(dá)時(shí)，Luc-3P及Luc-3M熒光

23、素酶表達(dá)載體熒光素酶活性比較結(jié)果
　　 用siRNA-HOXD13-1180分別與Luc-3P及Luc-3M熒光表達(dá)載體轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，當(dāng)HOXD13低表達(dá)時(shí)，Luc-3P啟動(dòng)子活性比轉(zhuǎn)染無(wú)義序列的活性相比升高了7.7倍；而Luc-3M啟動(dòng)子活性與轉(zhuǎn)染無(wú)義序列的活性相比只升高了0.9倍。說(shuō)明當(dāng)HOXD13低表達(dá)時(shí)結(jié)合在SOX9基因上游負(fù)調(diào)控區(qū)的HOXD13減少，從而增加SOX9基因啟動(dòng)子活性。
　　 12、HOXD13基因

24、低表達(dá)時(shí)，SOX9基因表達(dá)輕微上調(diào)而同時(shí)COL9A1基因兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)都顯著上調(diào)
　　 將s1RNA-HOXD13-1180瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的SOX9基因表達(dá)輕微上調(diào)而同時(shí)COL9A1基因兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)都顯著上調(diào)，說(shuō)明HOXD13很可能是SOX9基因的負(fù)調(diào)控因子。
　　 結(jié)論：
　　 1、SOX9蛋白能與COL9A1基因近端啟動(dòng)子-257至-275bp之間正調(diào)控元件結(jié)合，從而調(diào)控COL9A1基因的表達(dá)，

25、而使其表達(dá)上調(diào)，這可能與ICTEV畸形發(fā)生相關(guān)。
　　 2、SOX9基因的編碼區(qū)及5’側(cè)翼序列突變可能不是ICTEV發(fā)病的原因。
　　 3、無(wú)論是mRNA水平還是蛋白水平SOX9基因在ICTEV患者肌肉標(biāo)本(12/15，80%)表達(dá)都明顯升高，這可能與ICTEV畸形發(fā)生相關(guān)。
　　 4、HOXD13基因低表達(dá)使SOX9基因表達(dá)上調(diào)，SOX9基因高表達(dá)從而導(dǎo)致COL9A1基因表達(dá)上調(diào)，此機(jī)制可能參與ICTEV畸形的