線粒體轉(zhuǎn)錄因子A基因多態(tài)性在高原肺水腫發(fā)生中的作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：平原人進(jìn)入高原后，機(jī)體會(huì)發(fā)生一系列的代償適應(yīng)性變化，以適應(yīng)高原環(huán)境，這個(gè)過(guò)程稱為習(xí)服，若習(xí)服不良則可能發(fā)生高原病，例如高原肺水腫(high altitude pulmonary edema, HAPE)。線粒體是機(jī)體能量代謝的中心，在低氧細(xì)胞損傷和組織、細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的習(xí)服過(guò)程中有非常重要的作用。我室以往的研究結(jié)果提示，線粒體功能改變是細(xì)胞低氧習(xí)服-適應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。反之，線粒體結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，則可能是引起機(jī)體對(duì)于高原低氧環(huán)境習(xí)

2、服不良，甚至發(fā)生高原病(如HAPE)的重要因素。HAPE的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為與肺血管收縮，肺動(dòng)脈壓過(guò)度升高、肺毛細(xì)血管通透性增加、肺泡II型上皮細(xì)胞水清除障礙等因素有關(guān)。近來(lái)研究表明，缺氧時(shí)線粒體功能障礙，活性氧(reactive oxygen species, ROS)過(guò)度生成，在缺氧引起的肺血管平滑肌細(xì)胞收縮、肺水清除障礙的發(fā)生中起重要作用，缺氧線粒體功能障礙可通過(guò)多種途徑參與HAPE的發(fā)生。綜上所述，我們推測(cè)，HAPE的發(fā)

3、生可能與線粒體DNA（mitochondrial DNA， mtDNA）穩(wěn)定性降低，線粒體功能障礙有關(guān)，而線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A,TFAM）作為mtDNA穩(wěn)定性的重要調(diào)控因子，其基因多態(tài)性與HAPE發(fā)生易感性之間的關(guān)系有待深入研究。
　　方法：在西藏日喀則地區(qū)(海拔3836 m)收集漢族HAPE患者和高原健康對(duì)照外周血標(biāo)本各60例。HAPE患者納入標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)1995

4、年中華醫(yī)學(xué)會(huì)公布的高原肺水腫診斷標(biāo)準(zhǔn)，高原健康對(duì)照選取同期進(jìn)入日喀則地區(qū)的健康漢族人。所有受試者均排除已知的肺臟疾病、心血管疾病以及線粒體相關(guān)疾病等。采用全血基因組 DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用超螺旋敏感的qPCR方法檢測(cè)HAPE患者mtDNA穩(wěn)定性；采用普通PCR擴(kuò)增試劑盒，擴(kuò)增TFAM基因7個(gè)外顯子及其相鄰非編碼區(qū)序列并測(cè)序，經(jīng)與NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站獲取的人類TFAM基因序列(TFAM transcription fa

5、ctor A, mitochondrial[Homo samiens(human)], Gene ID:7019, updated on27-Mar-2014)比對(duì)，獲得單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotide polymorphism, SNP)并進(jìn)行基因分型，采用卡方檢驗(yàn)分析比較SNPs位點(diǎn)在HAPE患者和高原健康對(duì)照之間的等位基因和基因型頻率分布，采用Binary logistic分析比較各基因型的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，采用Ma

6、tch軟件(http://www.gene-regulation.com/pub/programs.html＃match)，在線分析TFAM基因全序列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；采用單因素方差分析或雙因素方差分析，比較TFAM SNPs位點(diǎn)基因型對(duì)mtDNA損傷的影響，并評(píng)價(jià)其在HAPE發(fā)生中的作用。
　　結(jié)果：⑴HAPE患者原始模板細(xì)胞色素b(cytochrome b, cytb)基因拷貝數(shù)(1.590±0.092)顯著高于高原健康對(duì)照(

7、1.245±0.076)(p=0.005)，HAPE患者加熱模板cyt b基因拷貝數(shù)(0.865±0.045)顯著低于高原健康對(duì)照(1.079±0.057)(p=0.004)；HAPE患者加熱模板 COXIII基因拷貝數(shù)(1.159±0.061)與高原健康對(duì)照(1.044±0.039)比較無(wú)顯著差異(p=0.115)，但其原始模板細(xì)胞色素 c氧化酶亞基(cytochrome c oxidase subunit, coxⅢ)基因拷貝數(shù)(1

8、.354±0.069)顯著高于高原健康對(duì)照(1.170±0.069)(p=0.049)。HAPE患者(1.291±0.154)與高原健康對(duì)照(1.167±0.094)4977bp片段缺失發(fā)生率無(wú)顯著性差異(P=0.494)。⑵在高原健康對(duì)照和HAPE患者TFAM的7個(gè)外顯子序列和部分相鄰非編碼區(qū)序列發(fā)現(xiàn)了4個(gè)SNP位點(diǎn)：A281T、C305T、rs1937、A3790G。其中rs1937多態(tài)性位點(diǎn)已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，而A281T、C305T、

9、A3790G多態(tài)性位點(diǎn)為本研究首次發(fā)現(xiàn)。經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，A281T位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄因子Staf結(jié)合序列內(nèi)，可能參與TFAM轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。⑶HAPE患者TFAM A281T多態(tài)性位點(diǎn)T等位基因(0％)和AT基因型頻率(0%)顯著低于高原健康對(duì)照(15%，30%)(p=0.000，p=0.000)，以A等位基因?yàn)閰⒄?，T等位基因?qū)τ贖APE發(fā)病具有保護(hù)作用(OR=0.850，CI：0.788-0.916)，以AA基因型為參照，AT基因型

10、是HAPE發(fā)生的保護(hù)性因素(OR=0.800，CI：0.705-0.908)。C305T、rs1937、A3790G位點(diǎn)的基因多態(tài)性與HAPE發(fā)生的易感性無(wú)顯著性相關(guān)(p>0.05)。⑷通過(guò)擴(kuò)增mtDNA編碼基因cytb反映mtDNA拷貝數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高原健康對(duì)照(1.355±0.102)和HAPE患者(1.590±0.092)281AA基因型的原始模板mtDNA拷貝數(shù)顯著高于281AT基因型(0.990±0.061)(p=0.048，p

11、=0.001)，且高原健康對(duì)照281AA基因型(1.061±0.065)和281AT基因型(1.118±0.117)加熱模板mtDNA拷貝數(shù)均顯著高于 HAPE患者281AA基因型(p=0.015，p=0.019)。通過(guò)擴(kuò)增 mtDNA編碼基因COX III反映mtDNA拷貝數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高原健康對(duì)照(1.281±0.079)和HAPE患者(1.354±0.069)281AA基因型的mtDNA原始模板mtDNA拷貝數(shù)顯著高于高原健康對(duì)照2

12、81AT基因型(0.912±0.058)(p=0.009，p=0.001)，各組間加熱模板 mtDNA拷貝數(shù)相差不顯著(F=1.363，p=0.260)。C305T、rs1937、A3790G位點(diǎn)的基因多態(tài)性對(duì)mtDNA穩(wěn)定性無(wú)顯著性影響(p>0.05)。
　　結(jié)論：①mtDNA穩(wěn)定性降低是HAPE發(fā)生的一個(gè)重要因素；②報(bào)導(dǎo)了TFAM A281T、C305T、A3790G SNPs位點(diǎn)；③TFAM A281T多態(tài)性位點(diǎn)的T等位基因