Visfatin在胰島β細(xì)胞的表達調(diào)控與功能研究.pdf

1、目的：探討visfatin在胰島細(xì)胞中的表達調(diào)控，細(xì)胞外及細(xì)胞內(nèi)visfatin對胰島細(xì)胞增殖、凋亡和胰島素釋放的影響，進一步研究其分子機制。 方法：①高脂喂養(yǎng)建立胰島素抵抗大鼠模型，高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗檢測胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，收集大鼠各組織標(biāo)本及血清，用realtime PCR方法檢測組織中visfatin mRNA表達，ELISA檢測血清visfatin水平，探討在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，體內(nèi)visfatin水平及其意義。②在體外

2、試驗中，4.0g/L葡萄糖、0.5mM棕櫚酸、20ng/mL TNF-α干預(yù)胰島細(xì)胞，Realtime PCR、Western blot方法檢測胰島細(xì)胞中visfatinmRNA和蛋白表達，并分析其與葡萄糖刺激胰島素分泌的相關(guān)性。③外源性visfatin(10-8M)和0.5mM棕櫚酸干預(yù)胰島細(xì)胞，MTT和流式細(xì)胞技術(shù)檢測胰島細(xì)胞增殖、凋亡的情況，Western blot方法檢測胰島細(xì)胞線粒體凋亡通路中各相關(guān)蛋白bcl-2、bax、ca

3、spase3、cytochrome C的表達，探討visfatin作用機制，觀察visfatin對細(xì)胞內(nèi)信號分子ERK1/2和Akt磷酸化水平的影響，并應(yīng)用該通路阻斷劑PD098059和LY294002及visfatin同時干預(yù)胰島細(xì)胞，觀察兩個信號通路在visfatin作用中的地位。④利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使胰島細(xì)胞過表達visfatin，MTT或流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期，并ELISA方法檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的葡萄糖刺激胰島素釋放

4、。 結(jié)果：⑴胰島素抵抗大鼠各組織中visfatin的表達均有所升高，并有顯著性差異，同時伴隨血循環(huán)中visfatin濃度的升高。⑵高糖、棕櫚酸和TNFα干預(yù)胰島細(xì)胞后，visfatin mRNA和蛋白均有不同程度的升高。不同濃度的葡萄糖和棕櫚酸干預(yù)后，隨葡萄糖和棕櫚酸濃度的升高，胰島細(xì)胞中visfatin表達量增加(p<0.05)，基礎(chǔ)胰島素分泌增加，刺激后胰島素分泌降低，胰島素分泌指數(shù)降低(p<0.05)，細(xì)胞內(nèi)胰島素含量下降

5、(p<0.05)。⑶Visfatin作用于胰島細(xì)胞24h-48h后，胰島細(xì)胞活力呈劑量依賴性增加(p<0.05)；10-8M visfatin處理24h可明顯降低棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(p<0.05)；棕櫚酸作用于胰島細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)bax表達升高，bcl-2表達下降、激活型caspase3和胞漿中細(xì)胞色素C的表達升高(p<0.05)，10-8M visfatin可顯著抑制棕櫚酸引起的細(xì)胞內(nèi)bcl-2、激活型caspase-3和胞漿中細(xì)胞色

6、素C表達的變化(p<0.05)，對bax表達的改變無顯著性差異。10-8M visfatin作用于胰島細(xì)胞后，呈劑量和時間依賴性促進細(xì)胞內(nèi)信號分子ERK1/2和Akt的磷酸化，而使用信號通路阻斷劑PD098059、LY294002可取消visfatin的抗凋亡作用。⑷MIN6細(xì)胞visfatin基因轉(zhuǎn)染后，與野生型細(xì)胞相比，增殖率明顯增加，棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率降低(p<0.05)，細(xì)胞周期改變，G0/G1期細(xì)胞百分比降低，S期細(xì)胞百分

7、比升高(p<0.05)。與野生型細(xì)胞相比，visfatin轉(zhuǎn)染細(xì)胞基礎(chǔ)胰島素分泌無改變，葡萄糖刺激胰島素釋放有所增加，但無顯著性差異(p=0.072)。 結(jié)論：①胰島素抵抗大鼠各組織中visfatin的表達增加，并伴有其血循環(huán)水平的升高，提示visfatin可能在胰島素抵抗慢性炎癥過程中介導(dǎo)體內(nèi)各組織的炎癥反應(yīng)。②胰島β細(xì)胞內(nèi)visfatin的表達受葡萄糖和棕櫚酸等能量代謝物質(zhì)的調(diào)控，并且其表達量與胰島素釋放指數(shù)有相關(guān)性，提示v