胎膜早破伴及不伴絨毛膜羊膜炎癥孕婦胎膜中MMP-9、MMP-8及TIMP-2差異表達(dá)研究.pdf

1、目的 通過研究胎膜中基質(zhì)金屬蛋白酶8和9(MMP-8，MMP-9)以及TIMP一2在胎膜早破伴絨毛膜羊膜炎癥及不伴絨毛膜羊膜炎癥的表達(dá)差異，并從臨床上探討MMP-8，MMP-9以及TIMP-2的表達(dá)變化與孕婦、新生兒疾病的相關(guān)性研究，探討MMP-9，MMP-8及TIMP-2與胎膜早破及絨毛膜羊膜炎的關(guān)系。 方法 1．病例選擇和實(shí)驗(yàn)分組：確立實(shí)驗(yàn)分組，分為對照組：無指征剖宮產(chǎn)組(無宮縮)16例，胎膜早破組(23例)

2、，以病理結(jié)果為準(zhǔn)，又分為胎膜早破不伴絨毛膜羊膜炎癥組10例，胎膜早破伴絨毛膜羊膜炎癥組13例，后者再分為輕度炎癥組6例，中度炎癥組3例，和重度炎癥組4例。 2．進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，摸索一抗最佳稀釋濃度，選擇修復(fù)種類，修復(fù)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)溫度，試劑用量，各試劑加入時(shí)間，讀片時(shí)間等其它試驗(yàn)條件。 3．根據(jù)陽性和陰性對照及參考文獻(xiàn)確定結(jié)果叛定的標(biāo)準(zhǔn)，如確定陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，確定陽性，陰性，強(qiáng)陽性，弱陽性評分標(biāo)準(zhǔn)。 4．按以上分組收集病人

3、外周血，陰道分泌物及胎膜標(biāo)本，進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)菌性陰道炎檢測，分泌物培養(yǎng)，胎膜標(biāo)本制作病理石蠟標(biāo)本，每份標(biāo)本切三張片，同時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行MMP一8，MMP-9及TIMP-2的免疫組織化學(xué)染色，并同時(shí)送檢到病理科檢測是否有絨毛膜羊膜炎。 5．免疫組化實(shí)驗(yàn)根據(jù)染色結(jié)果確定各項(xiàng)指標(biāo)在胎膜中著色部位，并按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)分，比較各指標(biāo)及MMP-8／TIMP-2，MlVlP-9／TIMP-2比值在不同組及不同母嬰臨床表現(xiàn)時(shí)的表達(dá)

4、差異。 6．免疫組化陰性對照和陽性對照，每次實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行陰性對照和陽性對照，陰性對照為不加一抗的片子，陽性對照為試劑公司提供的陽性空白片及陽性標(biāo)準(zhǔn)片。7．免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：MMP-8、MMP-9和TIMP-2的陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上未見明顯染色，觀察所選擇的高倍鏡視野中的所有細(xì)胞，記錄胎膜細(xì)胞呈陽性染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(％)并計(jì)分。陰性：小于5％或胎膜細(xì)胞顯色與背景一致，計(jì)O分。弱陽性：5％-10％

5、，1分。陽性：11％-50％，2分；強(qiáng)陽性：大于50％，3分。細(xì)胞著色強(qiáng)度以多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色(棕黃色)計(jì)分，強(qiáng)著色：著色和已知陽性片同樣強(qiáng)，3分。淺著色：著色淺，但與陰性對照片有明顯區(qū)別，1分。染色強(qiáng)度在淺著色和強(qiáng)著色之間為中等著色，2分。將陽性百分?jǐn)?shù)記分和細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分相加為MMP-9，MMP-8，TIMP一2的免疫組化積分。 結(jié)果 1．免疫組化實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化。 1．1修復(fù)條件的選擇。因?yàn)镸MP-8，TI

6、MP-2需要修復(fù)，經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)，比較了高壓修復(fù)、微波修復(fù)，及PH不同的檸檬酸緩沖液，最后選擇高壓修復(fù)，修復(fù)液選擇PH6．0的檸檬酸緩沖液。 1．2一抗?jié)舛鹊倪x擇，MMP-8使用的是濃縮液，因而我們比較了l：50，1：100，l：150不同梯度稀釋后加入一抗的染色結(jié)果，最后選擇1：100稀釋。 1．3加一抗后孵育時(shí)間和溫度的選擇。經(jīng)過比較37度孵育、室溫孵育，孵育1小時(shí)，孵育2小時(shí)及孵育過夜的結(jié)果，選擇室溫孵育1小時(shí)。

7、 2．MMP一9，MMP-8，TIMP-2的表達(dá)差異。 2．1MMP一9，MMP-8，TIMP-2主要在胎膜中的羊膜上皮，絨毛膜上皮及間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，其中陽性信號位于胞漿內(nèi)，呈棕黃色。 2．2對照組(無臨產(chǎn)癥狀的無指征剖宮產(chǎn))中，MMP-9表達(dá)均值為2．3l±0．70，MMP-8為0．44±0．51，TIMP-2為4．87±1．08：胎膜早破組中，MMP-9表達(dá)均值為4．56±1．26，MMP-8為2．53±L91，T

8、IMP-2為3．31±0．93：其中胎膜早破不合并絨毛膜羊膜炎組：MMP一9為4．37±1．20，MMP-8為0．81±O．40，TIMP一2為3．56±1.00；胎膜早破伴絨毛膜羊膜炎組MMP一9為4．75±1．34，MMP-84．25±1．06，TIMP-2為3．06±0．77。經(jīng)t、檢驗(yàn)，MMP-9，MMP-8和TIMP一2在對照組和胎膜早破組有顯著性差異。MMP-8只在胎膜早破伴絨毛膜羊膜炎的胎膜組織增高，在胎膜早破不伴絨毛膜羊

9、膜炎的胎膜組織中表達(dá)與對照無顯著性差異。 2．3在胎膜早破伴絨毛膜羊膜炎組，MMP-8在輕度，中度，重度的絨毛膜羊膜炎各組均值分別為：4．00±1．10；4．33±0．57；4．75±1．5。 2．4在孕婦外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)偏高時(shí)，MMP一8明顯偏高。 2．5在胎膜MMP一8值高時(shí)，孕婦伴有生殖道炎癥及新生兒感染綜合征的較多。 結(jié)論 1．胎膜早破的發(fā)生與基質(zhì)金屬蛋白酶8，基質(zhì)金屬蛋白酶9及TIMP-