hBcl-2和hIL-10基因冠脈轉(zhuǎn)染對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用.pdf

1、目的：研究Adv-hIL-10與Adv-hBcl-2單獨和聯(lián)合經(jīng)冠脈轉(zhuǎn)染對大鼠心肌抗缺血再灌注損傷的效應(yīng)，并探討其可能機制。 方法：(1)構(gòu)建復(fù)制缺陷型重組腺病毒：采用分子克隆手段獲得攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的重組質(zhì)粒、攜帶人白介素10(hIL-10)的重組質(zhì)粒PDC-hIL-10和B細(xì)胞淋巴瘤因子2(B-cellleukemia／lymphoma-2)的重組質(zhì)粒PDC-hBcl-2，以細(xì)胞內(nèi)同源重組法構(gòu)建復(fù)制缺陷

2、型重組腺病毒Adv-EGFP、Adv-hlL-10、Adv-hBcl-2。在293細(xì)胞內(nèi)分別擴增，應(yīng)用氯化銫密度梯度離心法純化病毒。經(jīng)氯化銫純化滴度分別為，Adv-EGFP：1.99x10<'9>Pfu／ml；Adv-hlL-10：2.1×10<'10>pfu／ml：Adv-hBcl-2：1.7×10<'10>pfu／ml。 (2)選擇70只S-D大鼠隨機分成7組(n=lO)。大鼠左側(cè)開胸，暴露心臟及升主動脈和肺動脈根部，用無損

3、傷血管鉗鉗夾于主、肺動脈根部，阻斷循環(huán)10秒鐘，同時用27號針頭于左心尖部注射各組相應(yīng)試劑0.1ml至左心室腔，使之在密閉的冠脈循環(huán)內(nèi)分布。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組僅注射0.1ml生理鹽水；第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組分別注射含Adv-EGFP、Adv-hBcl-2、Adv-hIL-10(1×10<'8>pfu)的生理鹽水；第Ⅶ組注射的鹽水包含Adv-Bcl-2和Adv-IL-10兩者。關(guān)胸蘇醒后，穩(wěn)定3天，使經(jīng)冠脈轉(zhuǎn)染的基因充分表達(dá)于心肌。 (3)冠

4、脈轉(zhuǎn)染3天后，再次暴露胸腔，在動脈圓錐與左心耳根部間結(jié)扎冠狀動脈左前降支(LAD)。結(jié)扎45min后，松開縫線使冠狀動脈再通240min。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。缺血預(yù)處理組在LAD結(jié)扎5min后開放5min，并重復(fù)3次，然后再行45min缺血、240min再灌注。 (4)采用Evan's Blue和TTC雙染色法測定心肌梗死面積；原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測心肌細(xì)胞凋亡；黃嘌呤氧化酶原理測定血清SOD活性，硫代巴比妥酸法測定

5、血清MDA的含量；光學(xué)顯微鏡下觀察心肌的炎癥改變；Western Blotting免疫印跡測定心肌基因表達(dá)的改變。 結(jié)果：(1)hBcl-2、hIL-10單獨和聯(lián)合轉(zhuǎn)染均能減少心肌梗死范圍。經(jīng)缺血預(yù)處理或hBcl-2、hlL-10單獨和聯(lián)合轉(zhuǎn)染后的心梗范圍(18.6±2.5％，30.5±4.2％，32.6±3.8％，22.4±2.6％)較缺血再灌注組和腺病毒對照組(47.5±5.2％，48.6±4.8％)明顯縮小。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組較單

6、獨轉(zhuǎn)染組的效果更好，更接近缺血預(yù)處理組。 (2)hBcl-2、hIL-10單獨和聯(lián)合轉(zhuǎn)染均能降低心肌細(xì)胞的凋亡率。在正常對照組未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡，而在缺血再灌注組和腺病毒對照組細(xì)胞凋亡明顯增多(24％，25％)，經(jīng)缺血預(yù)處理或hBcl-2、hIL-10單獨和聯(lián)合轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞凋亡明顯減少(5％，10％，14％，6％)。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組較單獨轉(zhuǎn)染組的抗凋亡效果更好，更接近缺血預(yù)處理組。 (3)hIL-10及聯(lián)合轉(zhuǎn)染組均能抑制心肌的

7、炎癥。 (4)hBcl-2、hlL-10單獨和聯(lián)合轉(zhuǎn)染均能提高SOD的活性，減少MDA的形成。正常對照組血清SOD活性為631.3±38.5NU／ml，缺血再灌注組和腺病毒對照組血清SOD活性降低至303.8±23.6Nu／nll和305.2±25.2NU／ml，而hBcl-2、hIL-10單獨和聯(lián)合轉(zhuǎn)染后血清SOD活性降低較少，分別為492.5±34.8NU／ml，436.0 ±29.8NU／ml，523.9±37.7NU／m

8、l，缺血預(yù)處理后血清SOD活性為533.8±29.8 NU／ml，聯(lián)合轉(zhuǎn)染組與其較接近。正常對照組MDA生成很少，僅1.7±0.2nm01／m1．缺血再灌注組和腺病毒對照組生成的MDA明顯增加至13.2±0.7和13.3±0.8 nmol／ml，而hBcl-2、hIL-10單獨和聯(lián)合轉(zhuǎn)染后MDA增加較前減少，分別為6.1±0.6 nmol／ml，7.6±0.8 nmol／ml，4.2±0.5nmol／ml。缺血預(yù)處理后MDA僅為3.5±

9、0.4 nmol／ml，聯(lián)合轉(zhuǎn)染組與其最接近。 (5)心肌表達(dá)的蛋白發(fā)生相應(yīng)的變化。hBcl-2轉(zhuǎn)染組Bcl-2／Bax比值增加，活化的caspase-3減少，hlL-10轉(zhuǎn)染組IL-10和Bcl-2的表達(dá)均增加，而TNF-a和caspase-3的表達(dá)受抑制。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組蛋白的表達(dá)起相加作用。 結(jié)論：(1)hBcl-2轉(zhuǎn)染能通過Bcl-2的過表達(dá)，增加Bcl2／Bax比值，減少caspase-3的活化來抑制凋亡；提高SOD