PPARγ1基因冠脈轉(zhuǎn)染對大鼠缺血再灌注心肌的保護(hù)作用及機制.pdf

1、目的：①構(gòu)建攜帶人過氧化物酶體增殖物激活受體γ1基因的重組腺病毒載體(Ad-PPARγ1)、攜帶增強型綠色熒光蛋白的重組腺病毒載體(Ad-EGFP)；②研究冠脈途徑轉(zhuǎn)染腺病毒載體到大鼠心肌的可行性，如果可行觀察PPARγ1基因轉(zhuǎn)染對缺血再灌注心肌是否有保護(hù)作用；③研究心肌缺血再灌注以后PPARγ1表達(dá)的改變以及PPARγl基因保護(hù)缺血再灌注心肌的機制。
　　 方法：實驗分三部分：①設(shè)計引物，利用PCR方法從含有目的基因的質(zhì)粒或者

2、cDNA文庫中釣取目的基因，將目的基因和pDC315質(zhì)粒載體分別酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后進(jìn)行定向連接或者交換，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞。對陽性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，再對PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序和對比分析，比對正確的即為構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒。構(gòu)建成功后行腺病毒包裝、擴增、純化、滴度測定。②通過預(yù)實驗確認(rèn)經(jīng)冠脈轉(zhuǎn)染的可行性。正式實驗SD大鼠隨機分為4組：Sham組轉(zhuǎn)染Ad-EGFP3天后，開胸后冠脈左前降支只過線不結(jié)扎；IR組轉(zhuǎn)染Ad

3、-EGFP3天后，心肌缺血30min，再灌注120min；IPC組轉(zhuǎn)染Ad-EGFP3天后，5min缺血,5min再灌注，重復(fù)3次后行心肌缺血30min，再灌注120min；PPARγ1組轉(zhuǎn)染Ad-PPARγ13天后，行心肌缺血30min，再灌注120min。記錄缺血再灌注前后不同時間點心功能指標(biāo)，檢測心律失常發(fā)生率并作出評分，測定肌鈣蛋白I含量，伊文氏藍(lán)灌注和TTC染色測定危險區(qū)面積和心梗面積，光鏡和電鏡觀察心肌組織形態(tài)學(xué)超微結(jié)構(gòu)變化

4、,TUNEL法測凋亡。③在第二部分的基礎(chǔ)上，用Western Blot測定蛋白含量，PT-PCR測定mRNA含量,研究心肌缺血再灌注后以及轉(zhuǎn)染后PPARγ1表達(dá)的變化，PPARγ1通路保護(hù)心肌作用中是否有Bcl-2、Bax發(fā)揮作用，以及激活PPARγ1通路是否能夠通過調(diào)控選擇素表達(dá)保護(hù)心肌。
　　 結(jié)果：①成功構(gòu)建.Ad-EGFP和Ad-PPARγ1。②預(yù)實驗確定經(jīng)冠脈途徑能夠轉(zhuǎn)染心肌，且最佳病毒載體滴度為109pfu/ml。再

5、灌注末，與Sham組相比，IR組多數(shù)心功能指標(biāo)明顯惡化，而IPC組和PPARγ1組多數(shù)心功能指標(biāo)優(yōu)于IR組，且心梗面積較小，凋亡指數(shù)較低，心肌組織形態(tài)學(xué)觀察也優(yōu)于IR組。③心肌缺血再灌注后PPARγ1表達(dá)下降，IPC和轉(zhuǎn)染PPARγ1基因后表達(dá)上調(diào)；激活PPARγ1通路能夠上調(diào)Bcl-2/Bax比率減少凋亡，能抑制選擇素E、P表達(dá)上調(diào)而抑制炎癥細(xì)胞聚積。
　　 結(jié)論：本課題成功構(gòu)建了Ad-PPARγ1和Ad-EGFP，再灌注以后