大鼠哮喘模型肺組織toll樣受體7基因mRNA表達(dá)水平的變化.pdf

1、近幾十年來(lái)，哮喘是兒科呼吸道所有疾病中發(fā)病率增長(zhǎng)最快的疾病之一，全世界學(xué)者對(duì)它的研究日益增加，發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的與哮喘相關(guān)的因素，對(duì)哮喘的發(fā)病機(jī)制、疾病發(fā)展因素以及治療上都有了更深的認(rèn)識(shí)，但到目前為止，還沒(méi)有完全明確哮喘的發(fā)病機(jī)制，也沒(méi)有一種能夠徹底治愈哮喘的治療方案。人類Toll樣受體(TLRs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類信號(hào)傳導(dǎo)跨膜受體，可以識(shí)別、結(jié)合病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，引發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放，在天然免疫防御中起重

2、要作用，并且能使抗原提呈細(xì)胞(APCs)識(shí)別病原體、產(chǎn)生刺激信號(hào)而啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)，因此TLRs是人體先天免疫和獲得性免疫的橋梁。TLR7作為TLRs家族中重要的成員，在生理、病理中均起著重要的作用，維持它的正常功能對(duì)機(jī)體的健康非常重要，功能減低或者功能過(guò)度增強(qiáng)都會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損害，造成相關(guān)疾病，如Molller-Larsen S等對(duì)它們的功能進(jìn)行研究，提示了TLR7和TLR8兩個(gè)受體在支氣管哮喘(以下簡(jiǎn)稱哮喘)中有著重要的作用機(jī)制。D

3、uQ.等發(fā)現(xiàn)在大鼠哮喘模型中，Imiquimod(一種TLR7的配體)能抑制氣道的重塑。Camateros P等發(fā)現(xiàn)大鼠模型中TLR7/8配體S28463阻止了慢性哮喘引起的氣道重塑。Moisan J等發(fā)現(xiàn)在MyD88依賴和非MK2依賴的過(guò)敏性哮喘中，TLR7的配體能夠防止由過(guò)敏原引起的氣道高反應(yīng)和嗜酸細(xì)胞增多癥，作者提示TLR7的激活在過(guò)敏性哮喘中有治療作用。Roponen M等學(xué)者選擇TLR7誘導(dǎo)的粘病毒抵御蛋白A、2'5'-寡腺苷

4、酸合成酶mRNA表達(dá)和IP-10( interferon-gamma inducible cytokineprotein10)蛋白水平三項(xiàng)功能性指標(biāo)，研究顯示經(jīng)過(guò)TLR7激動(dòng)劑激活后，哮喘患者這些指標(biāo)含量明顯比健康人低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血清總IgE與IP-10呈負(fù)相關(guān)，這些相關(guān)性僅出現(xiàn)于TLR7激活后，而不出現(xiàn)于TLR3激活，作者提示哮喘青少年中的TLR7功能較健康人降低了。以上資料表明，TLR7是與哮喘是非常密切的相關(guān)因子，但是Roponen

5、 M等學(xué)者僅僅對(duì)這三個(gè)指標(biāo)的作了研究，而TLR7激活后，通過(guò)胞質(zhì)的TIR功能區(qū)向胞內(nèi)傳遞信號(hào)，引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活NF-1B等轉(zhuǎn)錄因子，引起多種炎性細(xì)胞因子的分泌，如IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α等，這些因子的改變他們則沒(méi)有作相關(guān)研究，并且TLR7本身在哮喘中的表達(dá)如何，則無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。NF-kB作為TLR7的下游因子，而且也是與哮喘關(guān)系密切，所以本次研究我們一并對(duì)它與TLR7進(jìn)行觀察。
　　 目的：采用卵白

6、蛋白(OVA)霧化吸入致敏激發(fā)法復(fù)制哮喘大鼠模型，觀察哮喘模型大鼠肺部組織TLR7和核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB基因mRNA的表達(dá)水平，以及地塞米松(dexamethasone，Dex)干預(yù)前后哮喘模型大鼠肺部組織TLR7和核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB基因mRNA的表達(dá)水平變化，探討TLR7在哮喘發(fā)病和皮質(zhì)激素治療哮喘中的機(jī)制，為進(jìn)一步探討哮喘的防治方法奠定一定的基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴27只wister大鼠隨機(jī)分為3組：哮喘組：大鼠通過(guò)OVA腹

7、腔注射、霧化吸入致敏激發(fā)法復(fù)制哮喘大鼠模型，致敏后第22天開(kāi)始給予生理鹽水5ml/kg口服灌胃，一日一次，連續(xù)5天。干預(yù)組：大鼠通過(guò)OVA腹腔注射、霧化吸入致敏激發(fā)法復(fù)制哮喘大鼠模型，致敏后第22天開(kāi)始給予地塞米松5mg/kg口服灌胃，一日一次，連續(xù)5天。對(duì)照組：大鼠予以生理鹽水腹腔注射和霧化吸入，第22天后予生理鹽水5ml/kg灌胃，一日一次，連續(xù)5天。于末次灌胃后，用腹腔注射2％戊巴比妥鈉2.3ml/kg麻醉后處死大鼠，留取標(biāo)本以備

8、相關(guān)檢查。將右側(cè)肺組織迅速放入-80℃冰箱用作real time PCR測(cè)定。左側(cè)肺組織以中性福爾馬林固定，以備病理檢測(cè)用。⑵采用TRizol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，應(yīng)用Takara公司SYBR Green試劑盒對(duì)肺組織TLR7和NF-kB的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。⑶中性福爾馬林固定組織脫水后予二甲苯透明，用石蠟包埋切片，最后用HE染色和Giemsa染色，進(jìn)行病理觀察。
　　 結(jié)果：①哮喘組出現(xiàn)氣促等哮喘類似表現(xiàn)；病理發(fā)現(xiàn)氣道

9、壁增厚、分泌物增加、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等，符合哮喘表現(xiàn)。②哮喘組大鼠肺組織中TLR7mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.001)；Dex干預(yù)后TLR7mRNA的表達(dá)明顯下降(P=0.004)，但仍然顯著高于對(duì)照組水平(P<0.001)。③哮喘組大鼠肺組織中NF-kB mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P=0.001)；Dex干預(yù)后NF-kB mRNA的表達(dá)明顯下降(P=0.006)，但仍然顯著高于對(duì)照組水平(P=0.008)。