大菱鲆Toll樣受體22(TLR22)全長基因的克隆及表達分析.pdf

1、大菱鲆(Scophthalmus maximus)作為重要的海水養(yǎng)殖魚類品種之一,它的養(yǎng)殖范圍遍布世界各地,也包括我國北方沿海地區(qū)。然而,大菱鲆在海水養(yǎng)殖過程中極易受到包括大菱鲆虹彩病毒(TRBIV)在內(nèi)的多種致病微生物的感染,特別是隨著養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴大,其病害問題顯得日益嚴重,使大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)蒙受了巨大經(jīng)濟損失。作為最具代表性的模式識別受體,Toll樣受體(Toll-like rceptor, TLRs)不但能夠通過識別病原,激活下游

2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在非特異性免疫(先天性免疫)中發(fā)揮重要的作用,而且還能激活特異性免疫(獲得性免疫),是聯(lián)系先天性免疫和獲得性免疫的橋梁。研究證明,髓樣分化因子88(MyD88)和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing interferon-β, TRIF)是TLRs介導(dǎo)的信號通路中兩類重要的接頭分子,他們能夠分別介導(dǎo)MyD88依賴型信號通路和TRIF依賴型信號通路,使轉(zhuǎn)錄

3、因子活化,并最終促使促炎因子釋放和I型干擾素等的釋放,從而調(diào)動獲得性免疫應(yīng)答。對大菱鲆魚Toll樣受體進行相關(guān)研究將有助于更好的了解其免疫系統(tǒng),并能夠為大菱鲆疾病控制等方面的發(fā)展奠定基礎(chǔ),具有極為重要的應(yīng)用價值。到目前為止,還沒有關(guān)于大菱鲆TLRs研究的相關(guān)報道。
　　本文以大菱鲆作為研究對象,采用同源PCR克隆、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)、cDNA末端快速擴增(SMART RACE)和染色體步移法(Genome wa

4、lking PCR)等相關(guān)技術(shù),從大菱鲆的體腎組織中克隆得到了大菱鲆TLR22基因的全長 cDNA和基因組 DNA。大菱鲆TLR22 cDNA(GenBank登錄號:KJ606344)全長為4183 bp,包含一個長為2889 bp、可以編碼962個氨基酸的開放閱讀框,一個260 bp的5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)和一個1034 bp的3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)。TLR22基因組 DNA(GenBank登錄號:KJ606345)全長為

5、6530 bp,包括4個外顯子和3個內(nèi)含子。作為典型的I型跨膜受體,大菱鲆TLR22編碼的氨基酸與其他魚類 TLR22氨基酸序列一樣,具有共同的結(jié)構(gòu)特征:胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)有多個富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeat,LRR)構(gòu)成;胞內(nèi)區(qū)有一段保守的氨基酸殘基序列,稱之為TIR結(jié)構(gòu)域。通過氨基酸序列比對可以發(fā)現(xiàn),大菱鲆 TLR22與其它魚類 TLR22具有較高的同源性,高達47.1％-76.7%,其中,與牙鲆

6、TLR22的同源性最高(76.7%)。系統(tǒng)進化分析顯示大菱鲆TLR22屬于TLR22家族進化樹分支,與海水魚類的TLR22聚為一支,并且它與牙鲆TLR22基因的親緣關(guān)系最近。
　　本文采用qPCR技術(shù)對大菱鲆TLR22基因在腦、鰓、胃、腸、心、頭腎、體腎、肝、脾、性腺、肌肉和皮膚12個組織中的組織分布情況進行了研究。通過分析實驗結(jié)果得出,大菱鲆TLR22基因在所有被檢測的組織中是組成性表達。在頭腎、體腎和脾中較高水平表達,在腦、胃

7、、腸、心、肝臟、肌肉和皮膚中呈中等水平表達,在腮和性腺中低水平表達。由以上結(jié)果可以推斷,大菱鲆TLR22在其免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。
　　本文同樣采用qPCR就TLR22基因在大菱鲆中的表達規(guī)律與其在信號途徑中的地位與作用進行了相關(guān)研究。檢測了經(jīng)poly I:C、脂多糖(LPS)和TRBIV刺激后0h,3h,6h,12h,1d,2d,3d,5d時的大菱鲆TLR22在腮、頭腎、脾和肌肉中的表達情況。表達分析結(jié)果顯示,大菱鲆TLR

8、22在受到poly I:C、LPS和TRBIV刺激時都表現(xiàn)出了上調(diào)表達。在頭腎中,經(jīng)poly I:C、LPS和TRBIV刺激后的TLR22表達峰值分別出現(xiàn)在6h、6h、1d,表達量分別是對照水平的5.53倍、2.63倍和3.08倍。在脾臟中,經(jīng)poly I:C、LPS和TRBIV刺激后的TLR22表達峰值分別出現(xiàn)在6h、6h、6h,表達量分別是對照水平的3.72倍、3.30倍和3.12倍。在鰓中,經(jīng)poly I:C、LPS和TRBIV刺

9、激后的TLR22表達峰值分別出現(xiàn)在6h、6h、1d,表達量分別是對照水平的2.68倍、2.83倍和2.68倍。在肌肉中,經(jīng)poly I:C、LPS和TRBIV刺激后的TLR22表達峰值分別出現(xiàn)在1d、1d、1d,表達量分別是對照水平的5.71倍、2.56倍和6.24倍。這些結(jié)果為大菱鲆TLR22在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用提供了一定的證據(jù)。
　　本實驗為深入研究大菱鲆Toll受體的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制和有效開展大菱鲆疾病免疫防控工作