蘋果銹果類病毒的時(shí)空分布規(guī)律及對(duì)花青苷合成和相關(guān)基因的影響.pdf

1、蘋果銹果類病毒對(duì)果樹(shù)危害極大。近年來(lái)，蘋果銹果類病毒在我國(guó)蘋果主產(chǎn)區(qū)有蔓延趨勢(shì)，嚴(yán)重制約了我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前，對(duì)蘋果銹果類病毒的發(fā)生規(guī)律知之甚少，尚無(wú)有效的防治措施。本研究利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立并優(yōu)化了蘋果銹果類病毒檢測(cè)體系，并利用該體系研究蘋果銹果類病毒在樹(shù)體內(nèi)的時(shí)空分布規(guī)律，以期為蘋果銹果類病毒的檢測(cè)取樣和防治提供依據(jù)。同時(shí)，研究了蘋果銹果類病毒對(duì)果實(shí)花青苷合成及相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的影響，以期深入了解其發(fā)病機(jī)理。主要研

2、究結(jié)果如下:
　　1.蘋果銹果類病毒實(shí)時(shí)熒光PCR方法的建立及優(yōu)化
　　建立了蘋果銹果類病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，并對(duì)體系的特異性、靈敏性、適用性及重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證。研究表明:(1)靈敏度高，實(shí)時(shí)熒光PCR體系靈敏度高于常規(guī)RT-PCR100倍;(2)引物特異性強(qiáng)，能特異檢測(cè)ASSVd，對(duì)蘋果的其它三種病毒ACLSV、ASGV、ASPV未能檢測(cè)出;(3)適用性廣，可檢測(cè)出花蕾、葉片、根皮及枝皮不同組織的ASSVd;(4)重

3、復(fù)性好，重復(fù)3次測(cè)定100、10-1、10-2高、中、低3個(gè)濃度的cDNA模板，Ct值的變異系數(shù)均在誤差范圍內(nèi)。通過(guò)設(shè)計(jì)不同的引物濃度和退火溫度對(duì)本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，證明10μmol/L的引物濃度和60℃的退火溫度為最優(yōu)。
　　2.蘋果銹果類病毒河北分離物的克隆及序列分析
　　本研究以表現(xiàn)蘋果銹果類病毒癥狀的5個(gè)不同品種（斗南、嘎拉、華碩、中秋王、富士）的蘋果果實(shí)為材料。運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)確認(rèn)其攜帶ASSVd后進(jìn)

4、行基因克隆并測(cè)序，共得到14條不同的序列。運(yùn)用DNAMAN6.0分析所得的14條不同序列，同源性達(dá)98.49％，與NCBI報(bào)道的新疆、北京、韓國(guó)等地的ASSVd序列高度同源，同源性達(dá)95.35％。表明ASSVd序列的變異與品種沒(méi)有明顯相關(guān)性。
　　3.蘋果銹果類病毒的時(shí)空分布規(guī)律
　　本試驗(yàn)以攜帶ASSVd的富士蘋果樹(shù)為試材，利用建立的蘋果銹果類病毒實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)其葉片、技皮、根皮和果實(shí)進(jìn)行檢測(cè)，表明蘋果銹果類病毒在樹(shù)

5、體內(nèi)的時(shí)空分布存在差異:(1)樹(shù)冠下層組織的病毒相對(duì)含量要高于樹(shù)體上層對(duì)應(yīng)組織的病毒含量;(2)幼嫩組織的病毒相對(duì)含量低于成熟組織;(3)高溫季節(jié)的病毒含量要低于低溫季節(jié)。綜合試驗(yàn)全部采樣期中ASSVd在樹(shù)體內(nèi)的表達(dá)量結(jié)果，我們得出12月份根皮組織中ASSVd的相對(duì)表達(dá)量為最高。因此采集該時(shí)期的根皮組織進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果最為可靠。
　　4.蘋果銹果類病毒對(duì)花青苷合成及相關(guān)基因的影響
　　(1)攜帶ASSVd蘋果果皮和健康蘋果果皮

6、在解袋后的第0天到第14天的6個(gè)采集期，花青苷含量的變化均呈上升的趨勢(shì)，但健康果皮的花青苷含量均顯著高于感病果皮。
　　(2)對(duì)花青苷合成的相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的研究中發(fā)現(xiàn):解袋后第0天，健康果皮的MdCHS、MdF3H、MdDFR、MdANS、MdUFGT的相對(duì)表達(dá)量均比感病果皮高。在解袋后的第2天到第14天，除MdF3H外，其它4種基因的相對(duì)表達(dá)量在健康果皮中一直高于感病果皮;對(duì)花青苷合成的相關(guān)調(diào)節(jié)基因的研究中發(fā)現(xiàn):解袋后第0天健康果

7、皮中MdBHLH33和MdMYB11的相對(duì)表達(dá)量顯著高于感病果皮，隨后MdBHLH33、MdTTG1和MdMYB11的表達(dá)水平在感病果皮中一直低于健康果皮。這表明ASSVd影響了果皮中花青苷合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　(3)健康果皮與感病果皮中花青苷相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量與花青苷含量相關(guān)性不同。健康果皮中結(jié)構(gòu)基因MdUFGT與MdDFR的相對(duì)表達(dá)量與花青苷含量呈顯著正相關(guān)，其中MdDFR相對(duì)表達(dá)量與花青苷含量正相關(guān)性極顯著（相關(guān)系