TPX2在人甲狀腺髓樣癌中的表達(dá)及其對(duì)甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞增殖凋亡影響的研究.pdf

1、目的:TPX2(targetingproteinforXenopuskinesin-likeprotein2)是近年來研究較熱的一種微管相關(guān)蛋白，在有絲分裂紡錘體形成過程中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在探討TPX2在甲狀腺髓樣癌組織中的表達(dá)情況及其與甲狀腺髓樣癌患者臨床病理因素的相關(guān)性，并運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，通過特異性的抑制TPX2在甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞中的表達(dá)，研究其對(duì)甲狀腺髓樣癌細(xì)胞增殖、凋

2、亡以及周期分布的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，為以TPX2為靶點(diǎn)的甲狀腺髓樣癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)32例甲狀腺髓樣癌組織和8例正常甲狀腺組織中TPX2的表達(dá)，并分析其與甲狀腺髓樣癌臨床病理因素的聯(lián)系。
　　 2設(shè)計(jì)并合成4對(duì)靶向人TPX2基因的小干擾RNA(TPX2-siRNA-1、TPX2-siRNA-2、TPX2-siRNA-3、TPX2-siRNA-4)致TP

3、X2基因沉默。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。Real-timePCR檢測(cè)TPX2mRNA表達(dá)水平并篩選出最有效的siRNA。
　　 3采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期分布。采用Westernblot法檢測(cè)TPX2、Aurora-A、CyclinB1和野生型P53蛋白（wt-p53）表達(dá)水平。
　　 4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS16.0軟件分析，計(jì)數(shù)資料比較采用x2檢驗(yàn);計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)

4、準(zhǔn)差表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1免疫組化結(jié)果:TPX2蛋白在甲狀腺髓樣癌組織中的陽性表達(dá)率(62.5％，20/32)顯著高于正常甲狀腺組織(0％，0/8)(P＜0.05)。并且TPX2在甲狀腺髓樣癌組織中陽性表達(dá)率的高低與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小密切相關(guān)(P＜0.05)而與性別、年齡及是否存在甲狀腺炎癥無關(guān)(P＞0.05)。
　　 2轉(zhuǎn)

5、染效率的優(yōu)化及最佳siRNA篩選:Lipofectamine2000與熒光標(biāo)記siRNA分別以不同比例搭配時(shí)，轉(zhuǎn)染效率不同，以1∶2比例搭配時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，為（96.23±2.53）％（P＜0.05）。4對(duì)TPX2-siRNA轉(zhuǎn)染TT細(xì)胞24h后均發(fā)揮沉默效應(yīng)，尤以TPX2-siRNA2沉默效果最佳，TPX2-siRNA2組TPX2mRNA表達(dá)量較空白對(duì)照組下降（87.7±6.16）％(P＜0.05)，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間差異無

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3MTT檢測(cè)結(jié)果:TPX2-siRNA2作用于TT細(xì)胞48h后其增殖特性開始受到抑制，至72h抑制作用最為明顯，生長(zhǎng)抑制率26.7％。
　　 4FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡、周期分布結(jié)果:轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組顯著升高[（14.96±2.69）％vs（2.24±0.62）％](P＜0.05)，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 細(xì)胞周

7、期分布:轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，與空白對(duì)照及陰性對(duì)照組相比，TPX2-siRNA2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例上升(P＜0.05)，S期細(xì)胞比例下降(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染后發(fā)生了G2/M及G1/S雙期阻滯。
　　 5Westernblot結(jié)果:轉(zhuǎn)染后72小時(shí)westernblot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組TPX2蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組顯著降低（0.124±0.017vs0.407±0.022、0.393±0.020）(P＜0.05)，

8、而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TPX2-siRNA2轉(zhuǎn)染TT細(xì)胞后，與空白對(duì)照組相比，Aurora-A和CyclinB1的表達(dá)水平明顯下調(diào);wt-p53蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05);空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、甲狀腺髓樣癌組織中TPX2蛋白表達(dá)的陽性率高于正常甲狀腺組織，并且在甲狀腺髓樣癌組織中TPX2蛋白的陽性率高低與患者臨床分期