CCNG2在人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞中的表達(dá)及其對K1細(xì)胞增殖凋亡影響的研究.pdf

1、目的:細(xì)胞周期蛋白G2(CyclinG2，CCNG2)是細(xì)胞周期蛋白家族中發(fā)現(xiàn)較晚的一員。近年來對其的研究發(fā)現(xiàn)，CCNG2具有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，負(fù)性調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的作用。本研究旨在探討CCNG2基因在甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對K1細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并期望通過實(shí)驗(yàn)了解CCNG2基因在上述過程中可能的作用機(jī)制，為以CCNG2為靶點(diǎn)的甲狀腺乳頭狀癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1構(gòu)建載有CCNG2基

2、因的質(zhì)粒pEGFP-N1-CCNG2，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件后轉(zhuǎn)染體外甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞，Western blot法檢測轉(zhuǎn)染結(jié)果。
　　2 MTT、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測空白對照組、陰性對照組、實(shí)驗(yàn)組K1細(xì)胞增殖、凋亡情況。Western blot法、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測CCNG2、p53、mdm2蛋白表達(dá)情況。
　　3上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次或以上，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示。計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)后采用方差分析，多組

3、數(shù)據(jù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化及檢測:不同比例DNA與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000混合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，各組轉(zhuǎn)染效率有差異，其中DNA(ug):Lipofectamine2000(ul)為1∶5時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)(77.33±3.79)％(P＜0.05);不同細(xì)胞融合度時(shí)接受轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率有差

4、異，以細(xì)胞融合度達(dá)50～60％時(shí)轉(zhuǎn)染效率最佳，為(90.33±1.53)％(P＜0.05)。
　　2 MTT檢測細(xì)胞增殖結(jié)果:分別于轉(zhuǎn)染24h、48h、72h、96h行MTT檢測，與對照組比較實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)生長抑制，并于轉(zhuǎn)染72小時(shí)抑制效應(yīng)最明顯達(dá)35.40％(P＜0.05)，空白對照組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3 FCM檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果:轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組較空白對照組、陰性對照組早期凋

5、亡率明顯升高[(5.48±0.35)％ vs(1.06±0.05)％、(1.12±0.09)％](P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組較空白對照組、陰性對照組晚期凋亡率顯著升高[(9.90±0.94)％ vs(2.65±0.20)％、(1.58±0.28)％]（P＜0.05），空白對照組與陰性對照組比較，細(xì)胞早期、晚期凋亡率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4 Western Blot檢測結(jié)果:轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組CCNG2蛋白相對表

6、達(dá)量較空白對照組、陰性對照組顯著升高(0.72±0.053 vs0.36±0.032、0.37±0.040)(P＜0.05)，而兩對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，p53、mdm2蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05)，空白對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。分別轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CCNG224h、48h、72h，CCNG2蛋白表達(dá)持續(xù)增加，p53、mdm2蛋白表達(dá)水平

7、上調(diào)且與CCNG2表達(dá)趨勢具有一致性。
　　5免疫細(xì)胞化學(xué)染色法結(jié)果:轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CCNG248h后實(shí)驗(yàn)組CCNG2、p53、mdm2蛋白表達(dá)陽性水平明顯高于對照組。
　　結(jié)論:
　　1體外實(shí)驗(yàn)顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)使CCNG2基因在甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞產(chǎn)生過表達(dá)并具有抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。
　　2轉(zhuǎn)染CCNG2基因后CCNG2、p53蛋白表達(dá)上調(diào)，推測CCNG2通過上調(diào)p53蛋白表達(dá)水平起到