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1、目的:銅綠假單胞菌(Pa)是一種臨床上常見(jiàn)的可引起嚴(yán)重院內(nèi)獲得性感染的條件致病菌,由于其固有與獲得性耐藥,使治療成為一大難題。亞胺培南(IPM)是臨床銅綠假單胞菌抗感染治療的常用碳青霉烯類抗生素,應(yīng)用廣泛,隨之引起的耐藥菌株也逐漸上升,而耐碳青霉烯類抗生素的Pa往往都是多重耐藥株,給臨床的抗感染治療帶來(lái)很大的困擾。本研究通過(guò)對(duì)從臨床標(biāo)本中分離的亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌(IRPa)的耐藥特征進(jìn)行分析、檢測(cè)相關(guān)耐藥基因以及整合子攜帶的耐藥基
2、因等,初步探討銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥的分子機(jī)制,從而了解不同的耐藥機(jī)制間相互作用的規(guī)律以及耐藥基因在菌株問(wèn)水平傳播的特點(diǎn),為指導(dǎo)臨床用藥提供幫助。 方法: 1、藥敏實(shí)驗(yàn)和三維實(shí)驗(yàn) 收集2003~2007年臨床分離的220株P(guān)a,對(duì)這些菌株采用K-B法測(cè)定10種臨床常用抗生素的藥敏情況,同時(shí)采用瓊脂稀釋法檢測(cè)亞胺培南的最低抑菌濃度(MIC),篩選出對(duì)亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌,并分析其對(duì)其它抗生素的藥物敏感率;
3、采用三維實(shí)驗(yàn)的方法分析220株P(guān)a產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的類型。 2、碳青霉烯類水解酶和oprD2蛋白的檢測(cè) 針對(duì)鑒定的IRPa菌株,采用普通PCR方法檢測(cè)具有碳青霉烯水解作用的β內(nèi)酰胺酶耐藥摹因(GES、KPC、SPM、VIM、IMP、GIM基因)和oprD2基因,采用多重PCR的方法檢測(cè)OXA型基因和質(zhì)粒攜帶的AmpC酶基因,用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)oprD2蛋白基因表達(dá)情況;同時(shí)對(duì)產(chǎn)AmpC酶的Pa(25株,含IMP耐
4、藥和敏感株)用RT-PCR方法檢測(cè)AmpC酶基因的表達(dá)量情況。 3.整合子的鑒定與分析 利用整合酶基因PCR-RFLP方法篩選攜帶整合子的菌株,并對(duì)這些整合子進(jìn)行分類;整合酶陽(yáng)性菌株用普通PCR擴(kuò)增檢測(cè)整合子的qacEΔ1-sull基因和整合子可變區(qū)的耐藥基因盒,并對(duì)整合子可變區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及序列分析。探討整合子攜帶的耐藥基因盒是否介導(dǎo)銅綠假單胞菌對(duì)IPM的耐藥。 結(jié)果: 1.共篩選出IRPa菌株74
5、株,IRPa對(duì)美羅培南、三代頭孢類抗生素、氨曲南藥物的耐藥率都超過(guò)50%以上,特別是對(duì)頭孢噻肟的耐藥率達(dá)到81.08%,而對(duì)多黏菌素B、氨基糖苷類藥物和環(huán)丙沙星的敏感率相對(duì)較高,多粘菌素B的敏感率為100%,阿米卡星為70.27%,慶大霉素為62.16%,環(huán)丙沙星為51.35%。 2.本次試驗(yàn)共檢測(cè)到產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶菌株43株,β內(nèi)酰胺酶的檢出率為19.55%(43/220),其中產(chǎn)AmpC酶、超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)、金屬酶
6、(MBL)、同時(shí)產(chǎn)生AmpC和ESBLs兩種酶(SSBLs)、未知酶型銅綠假單胞菌的構(gòu)成比分別是58.14%(25/43)、18.6%(8/43)、4.65%(2/43)、2.33%(1/43)和16.28%(7/43)。43株產(chǎn)酶菌株中對(duì)IPM耐藥的產(chǎn)酶株共有26株,這26株菌中除了產(chǎn)金屬酶(2株)與未知酶型菌株(7株)之外,其余均為產(chǎn)AmpC酶菌株,共17株,占總數(shù)的65.4%(17/26)。通過(guò)檢測(cè)AmpC酶對(duì)亞胺培南的水解實(shí)驗(yàn)可
7、以發(fā)現(xiàn),有7株菌所產(chǎn)的AmpC酶可能對(duì)IPM有一定的水解作用。 3.PCR和多重PCR檢測(cè)銅綠假單胞菌IPM耐藥相關(guān)β內(nèi)酰胺酶基因,除I1197這株菌DHA摹因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,測(cè)序結(jié)果為DHA-1外,其余菌株IPM耐藥相關(guān)β內(nèi)酰胺酶基因PCR結(jié)果均為陰性;oprD2基因檢測(cè)為陰性的菌株有40株,占IRPa總數(shù)的54.05%(40/74)。 4.熒光定量RT-PCR對(duì)IRPa的oprD2摹因表達(dá)蛋白量的檢測(cè),其結(jié)果與普通P
8、CR檢測(cè)結(jié)果相比較,大部分菌株的檢測(cè)結(jié)果兩者相一致;25株產(chǎn)AmpC酶陽(yáng)性菌均有不同程度Ampc酶基因表達(dá)量升高,其中,1株攜帶DHA質(zhì)粒型AmpC酶基因,12株菌OprD2基因表達(dá)量減低,這些菌株均對(duì)亞胺培南耐藥,13株菌OprD2基因表達(dá)量正常,其中僅5株菌對(duì)亞胺培南耐藥;粗提酶能微弱水解IPM的7株菌,其AmpC酶基因的表達(dá)量均有明顯升高,其中5株菌同時(shí)伴有oprD2基因表達(dá)量降低。 5.74株IRPa中檢出16株(22.
9、86%)攜帶整合酶基因,這些基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶HinfⅠ酶切分析,均為Ⅰ類整合子,并且qacEΔ1-sull基因擴(kuò)增均為陽(yáng)性。16株整合酶基因陽(yáng)性的IRPa中,有14例檢出整合子可變區(qū),共得到7種整合子耐藥基因盒的組合形式,這7種組合均攜帶有氨基糖苷類修飾酶基因,有些攜帶β內(nèi)酰胺酶基因及未知功能的基因。其中有4種為新發(fā)現(xiàn)的整合子可變區(qū)組合:①aac(6)-Ⅱ-catB3-ORFⅡ-ORFⅢ組合與②aac(6)-Ⅱ-unk
10、nown-CatB3組合有相同的耐藥基因aac(6)-Ⅱ和catB3,aac6-Ⅱ基因編碼對(duì)阿米卡星、奈替米星和妥布霉素的耐藥;catB3基因編碼氯乙?;D(zhuǎn)移酶,介導(dǎo)對(duì)氯霉素的耐藥;ORFⅡ基因編碼的蛋白質(zhì)可能是一種以RNA為模板的DNA聚合酶,也就是逆轉(zhuǎn)錄酶;unknown基因可能是一種新的轉(zhuǎn)座酶基因。③blaIMP-9-aacA4-OXA-10-aadA2-like組合,IMP-9是金屬酶基因,編碼對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥;aacA4
11、基因編碼氨基葡糖苷6-N-乙?;D(zhuǎn)移酶,產(chǎn)生對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥,OXA-10β內(nèi)酰胺酶基因編碼對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松和氨曲南的低水平耐藥;aadA2基因編碼對(duì)大觀霉素和鏈霉素的耐藥。④aac(6)-ⅡblaP1b-aadA2組合,其中blaP1b基因編碼對(duì)羧芐青霉素的耐藥。這些新發(fā)現(xiàn)的基因組合已在NCBI(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站)的Genebank上登錄,登陸序列號(hào)分別為FJ917747、FJ817422、FJ655384和FJ
12、958368、FJ817423。 結(jié)論: 1.耐亞胺培南的銅綠假單胞菌對(duì)多種抗生素呈多重耐藥和交叉耐藥。針對(duì)IRPa引起的感染,臨床醫(yī)生可根據(jù)病人具體情況,使用敏感性相對(duì)較高的抗生素進(jìn)行治療,如環(huán)丙沙星或氨基糖苷類藥物,對(duì)于泛耐藥的菌株可將多粘菌素B作為經(jīng)驗(yàn)用藥的選擇之一。 2.在產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的菌株中,產(chǎn)AmpC酶的菌株檢出率是最高的,在產(chǎn)AmpC酶的銅綠假單胞菌中,存在一定數(shù)量(28%)能產(chǎn)生水解IMP的Amp
13、C酶菌株,AmpC酶水解IMP可能與Pa菌株的產(chǎn)酶量有關(guān),說(shuō)明AmpC酶的存在可能是銅綠假單胞菌對(duì)三代頭孢類抗生素以及IPM耐藥的一個(gè)重要因素。 3.oprD2蛋白的突變或表達(dá)量降低足IRPa對(duì)IPM耐藥的主要原因;無(wú)論P(yáng)a AmpC酶的表達(dá)量是高還是低,如果合并有oprD2基因表達(dá)量減少或缺失,均會(huì)導(dǎo)致其對(duì)亞胺培南耐藥;如果僅產(chǎn)生AmpC酶,但oprD2基因表達(dá)量正常,大部分菌株對(duì)亞胺培南敏感,小部分菌株可通過(guò)產(chǎn)酶或其它的機(jī)制
14、對(duì)IMP耐藥。總的來(lái)說(shuō),產(chǎn)AmpC酶銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥可能是AmpC酶表達(dá)量增加和oprD2表達(dá)量減低共同作用的結(jié)果,而oprD2蛋白缺失的作用可能更為突出。 4.整合酶陽(yáng)性的IRPa中,僅檢出Ⅰ類整合子,未發(fā)現(xiàn)其它類型整合子。在這些Ⅰ類整合子中,共有7種整合子耐藥基因盒的組合形式,其中僅兩株IRPa的Ⅰ類整合子中攜帶的.IMP-9基因與IPM的耐藥有關(guān),其它菌株的整合子中未檢測(cè)到相關(guān)的碳青霉烯類β內(nèi)酰胺酶的基因盒,其攜
15、帶的基因盒主要是介導(dǎo)Pa對(duì)氨基糖苷類與其它β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥,新發(fā)現(xiàn)4種整合子可變區(qū)耐藥基因盒組合:sac(6)-Ⅱ-unsown-CatB3、 aac(6)-Ⅱ-catB3-ORFⅡ-ORFⅢ、blaIMP-9-aad4-OXA-10和aadA2-like、asc(6’)-Ⅱ-blaP1b-aadA2,在NCBI的GENE BANK上登陸序列號(hào)分別為FJ917747、FJ817422、FJ655384和FJ958368、FJ8174
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