褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)Trxl,TRP14和Prxl基因的克隆、表達和轉錄水平的免疫刺激反應.pdf

1、褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）是一種非常珍貴的經濟魚類，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大化，養(yǎng)殖中面臨的魚類疾病感染問題愈發(fā)嚴峻。為了更好地找到解決問題的辦法，了解魚類的免疫機制是很必要的。本文主要是研究了三個褐牙鲆抗氧化相關基因硫氧還蛋白1基因（thioredoxin1，PoTrx1)、硫氧還蛋白相關蛋白14（thioredoxin related protein14，PoTRP14）和過氧化物酶基因1（Peroxidase

2、1，PoPrx1）基因的基因序列信息和各組織、不同發(fā)育時期的表達差異，以及在接受免疫刺激的條件下，表達模式會有何變化。本研究采用RACE(Rapid amplificationof cDNA ends，RACE)技術克隆得到PoTrx1、PoTRP14基因的cDNA全長，并運用各種生物信息學軟件對序列信息進行分析和預測，預測了所編碼相關蛋白的基本信息、進行了物種間同源性的分析，并構建了各物種間的進化樹。RT-PCR法分析了PoTrx1、

3、PoTRP14基因在成體魚八個不同組織和十四個不同胚胎發(fā)育時期的表達差異。同時建立了褐牙鲆肝臟細胞原代培養(yǎng)系統，分別用LPS、CuSO4和H2O2刺激肝臟細胞，然后用RT-PCR法分析免疫刺激前后PoTrx1、PoTRP14和PoPrx1基因的表達模式有何變化。研究成果作如下分述:
　　1、PoTrx1基因全長cDNA的克隆和表達分析
　　運用RACE技術克隆得到PoTrx1基因cDNA全長為723bp，其中包括366bp的

4、開放閱讀框(ORF)、324bp的3'-UTR和33bp的5'-UTR。預測該基因可編碼121個氨基酸，理論分子量為15.90kDa，理論等電點為5.39。ORF中具有Trx1基因典型的保守區(qū)CGPC。同時分析了Trx1在不同物種之間的相似性，其中PoTrx1同半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、條石鯛（Oplegnathus fasciatus）和松江鱸（Trachidermus fasciatus）的一致度分別

5、為:60％、67％和61％。RT-PCR法檢測顯示PoTrx1在成體魚八個組織中都有表達，尤其在小腸中的表達量最高，其次為腎臟、心臟、肝臟、腦和鰓，在肌肉組織中的表達量最低。組織表達的差異中，PoTrx1基因在免疫相關器官中的表達較高，這與Trx1執(zhí)行的免疫功能相關。同時檢測了PoTrx1基因在14個胚胎不同發(fā)育時期的表達情況，各發(fā)育時期的表達量有顯著的差異，PoTrx1在未受精卵時期就已經開始表達，然而從1細胞期開始直到囊胚期的表達量

6、都是相對穩(wěn)定的低表達量，從神經胚期開始，表達量劇增，在體節(jié)期達到高峰，出膜期以及出膜一天表達量開始下降。建立褐牙鲆肝臟細胞原代培養(yǎng)系統，選用LPS、CuSO4和H2O2三組刺激物刺激肝臟細胞，PoTrx1的表達出現了顯著的上調。LPS刺激之后，6h之后達到一個表達的高峰，隨后在24h之后又出現的新的表達高峰;CuSO4刺激之后2h后迅速達到高峰，隨后降低，維持一個較低的表達水平，在48h又出現了新的表達高峰;H2O2刺激組則是在12h和

7、24h出現了明顯的表達高峰。免疫刺激之后，PoTrx1表達量的上調說明Trx1基因功能同機體的免疫和抗氧化密不可分。
　　2、PoTRP14基因全長cDNA的克隆和表達分析
　　PoTRP14基因cDNA序列全長為909bp，其中包括58bp的5'-UTR區(qū)和479bp的3'-UTR區(qū)，預測372bp的ORF區(qū)可編碼123個氨基酸，理論分子量和理論等電點分別為14.01kDa和5.70。ORF區(qū)具有TRP14基因共有的CPD

8、C保守序列。PoTRP14同裸蓋魚（Anoplopoma fimbria）、大西洋鮭（Salmo salar）和點帶石斑魚（Epinephelus coioides）的一致度均為87％，同松江鱸(Trachidermus fasciatus)的一致度為86％。經RT-PCR檢測分析，PoTRP14在各組織中都有表達，小腸中的表達量最高，其次為腎臟、心臟、肝臟、腦和鰓，在脾臟組織中的表達量最低。Po TRP14基因在不同胚胎發(fā)育時期的表達

9、總體維持著較高的表達量，在未受精卵中有較高的表達量，隨后的幾個時期表達量相對穩(wěn)定，高囊胚期相對低，在出膜前表達量出現一個急劇增長的表達高峰，隨后急劇下降。PoTRP14基因在免疫刺激后肝臟細胞中的表達亦出現明顯的上調，PoTRP14基因在LPS刺激后的6h和48h分別出現表達高峰;CuSO4刺激的2h和48h出現表達高峰，明顯高于其他實驗組;H2O2刺激后的12h和48h有表達高峰。
　　3、PoPrx1基因全長cDNA的克隆和表