褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)Trxl,TRP14和Prxl基因的克隆、表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平的免疫刺激反應(yīng).pdf

1、褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）是一種非常珍貴的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大化，養(yǎng)殖中面臨的魚(yú)類(lèi)疾病感染問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)峻。為了更好地找到解決問(wèn)題的辦法，了解魚(yú)類(lèi)的免疫機(jī)制是很必要的。本文主要是研究了三個(gè)褐牙鲆抗氧化相關(guān)基因硫氧還蛋白1基因（thioredoxin1，PoTrx1)、硫氧還蛋白相關(guān)蛋白14（thioredoxin related protein14，PoTRP14）和過(guò)氧化物酶基因1（Peroxidase

2、1，PoPrx1）基因的基因序列信息和各組織、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異，以及在接受免疫刺激的條件下，表達(dá)模式會(huì)有何變化。本研究采用RACE(Rapid amplificationof cDNA ends，RACE)技術(shù)克隆得到PoTrx1、PoTRP14基因的cDNA全長(zhǎng)，并運(yùn)用各種生物信息學(xué)軟件對(duì)序列信息進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)了所編碼相關(guān)蛋白的基本信息、進(jìn)行了物種間同源性的分析，并構(gòu)建了各物種間的進(jìn)化樹(shù)。RT-PCR法分析了PoTrx1、

3、PoTRP14基因在成體魚(yú)八個(gè)不同組織和十四個(gè)不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異。同時(shí)建立了褐牙鲆肝臟細(xì)胞原代培養(yǎng)系統(tǒng)，分別用LPS、CuSO4和H2O2刺激肝臟細(xì)胞，然后用RT-PCR法分析免疫刺激前后PoTrx1、PoTRP14和PoPrx1基因的表達(dá)模式有何變化。研究成果作如下分述:
　　1、PoTrx1基因全長(zhǎng)cDNA的克隆和表達(dá)分析
　　運(yùn)用RACE技術(shù)克隆得到PoTrx1基因cDNA全長(zhǎng)為723bp，其中包括366bp的

4、開(kāi)放閱讀框(ORF)、324bp的3'-UTR和33bp的5'-UTR。預(yù)測(cè)該基因可編碼121個(gè)氨基酸，理論分子量為15.90kDa，理論等電點(diǎn)為5.39。ORF中具有Trx1基因典型的保守區(qū)CGPC。同時(shí)分析了Trx1在不同物種之間的相似性，其中PoTrx1同半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、條石鯛（Oplegnathus fasciatus）和松江鱸（Trachidermus fasciatus）的一致度分別

5、為:60％、67％和61％。RT-PCR法檢測(cè)顯示PoTrx1在成體魚(yú)八個(gè)組織中都有表達(dá)，尤其在小腸中的表達(dá)量最高，其次為腎臟、心臟、肝臟、腦和鰓，在肌肉組織中的表達(dá)量最低。組織表達(dá)的差異中，PoTrx1基因在免疫相關(guān)器官中的表達(dá)較高，這與Trx1執(zhí)行的免疫功能相關(guān)。同時(shí)檢測(cè)了PoTrx1基因在14個(gè)胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量有顯著的差異，PoTrx1在未受精卵時(shí)期就已經(jīng)開(kāi)始表達(dá)，然而從1細(xì)胞期開(kāi)始直到囊胚期的表達(dá)量

6、都是相對(duì)穩(wěn)定的低表達(dá)量，從神經(jīng)胚期開(kāi)始，表達(dá)量劇增，在體節(jié)期達(dá)到高峰，出膜期以及出膜一天表達(dá)量開(kāi)始下降。建立褐牙鲆肝臟細(xì)胞原代培養(yǎng)系統(tǒng)，選用LPS、CuSO4和H2O2三組刺激物刺激肝臟細(xì)胞，PoTrx1的表達(dá)出現(xiàn)了顯著的上調(diào)。LPS刺激之后，6h之后達(dá)到一個(gè)表達(dá)的高峰，隨后在24h之后又出現(xiàn)的新的表達(dá)高峰;CuSO4刺激之后2h后迅速達(dá)到高峰，隨后降低，維持一個(gè)較低的表達(dá)水平，在48h又出現(xiàn)了新的表達(dá)高峰;H2O2刺激組則是在12h和

7、24h出現(xiàn)了明顯的表達(dá)高峰。免疫刺激之后，PoTrx1表達(dá)量的上調(diào)說(shuō)明Trx1基因功能同機(jī)體的免疫和抗氧化密不可分。
　　2、PoTRP14基因全長(zhǎng)cDNA的克隆和表達(dá)分析
　　PoTRP14基因cDNA序列全長(zhǎng)為909bp，其中包括58bp的5'-UTR區(qū)和479bp的3'-UTR區(qū)，預(yù)測(cè)372bp的ORF區(qū)可編碼123個(gè)氨基酸，理論分子量和理論等電點(diǎn)分別為14.01kDa和5.70。ORF區(qū)具有TRP14基因共有的CPD

8、C保守序列。PoTRP14同裸蓋魚(yú)（Anoplopoma fimbria）、大西洋鮭（Salmo salar）和點(diǎn)帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）的一致度均為87％，同松江鱸(Trachidermus fasciatus)的一致度為86％。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)分析，PoTRP14在各組織中都有表達(dá)，小腸中的表達(dá)量最高，其次為腎臟、心臟、肝臟、腦和鰓，在脾臟組織中的表達(dá)量最低。Po TRP14基因在不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

9、總體維持著較高的表達(dá)量，在未受精卵中有較高的表達(dá)量，隨后的幾個(gè)時(shí)期表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，高囊胚期相對(duì)低，在出膜前表達(dá)量出現(xiàn)一個(gè)急劇增長(zhǎng)的表達(dá)高峰，隨后急劇下降。PoTRP14基因在免疫刺激后肝臟細(xì)胞中的表達(dá)亦出現(xiàn)明顯的上調(diào)，PoTRP14基因在LPS刺激后的6h和48h分別出現(xiàn)表達(dá)高峰;CuSO4刺激的2h和48h出現(xiàn)表達(dá)高峰，明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組;H2O2刺激后的12h和48h有表達(dá)高峰。
　　3、PoPrx1基因全長(zhǎng)cDNA的克隆和表