30211.牙鲆免疫相關(guān)基因的克隆與表達分析

1、中國海洋大學(xué)博士學(xué)位論文牙鲆免疫相關(guān)基因的克隆與表達分析姓名：李朔申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：海洋生物學(xué)指導(dǎo)教師：張全啟200906012牙鲆免疫相關(guān)基因l(Polivaceusimmunerelatedgene1，PolRl)的克隆及分析通過DDPCR和RACE技術(shù)，拼接得到了長度為997bp的牙鲆免疫相關(guān)基因l(EU224373)全長cDNA，其中5’UTR為523bp，ORF為300bp，3’UTR為174bp，可編碼99個氨基酸，預(yù)

2、測的分子量約為1046KD，等電點為814?；蚪MDNA序列共含有2個內(nèi)含子，3個外顯子。編碼的蛋白含有一個19個氨基酸組成的信號肽，為分泌型蛋白。通過結(jié)構(gòu)功能域的查找，發(fā)現(xiàn)此蛋白一個原核生物膜脂蛋白的附著點。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對后并沒有發(fā)現(xiàn)與之相似的序列，因此給此基因命名為牙鲆免疫相關(guān)基因1(Polivaceusimmunerelatedgene1，PolRl)。半定量RTPCR結(jié)果表明，對照組中，在所有的組織器官(肝臟、腎臟、脾臟、

3、鰓、小腸、心臟、肌肉)中均未檢測到PolRl的表達。鰻弧菌注射后，在所有的組織中均檢測到了PolRl的表達，且隨著時間的延長，表達量有明顯上升的趨勢。推測該基因的編碼產(chǎn)物可能是抗菌肽類似的小分子直接參與消滅病原生物或者作為信號分子通過與病原生物的膜結(jié)合識別出外界的入侵從而引起機體內(nèi)部的級聯(lián)免疫反應(yīng)。以pET32a為表達質(zhì)粒，將PolRl的成熟肽基因序列插入其中構(gòu)建了pET32aPolRl重組質(zhì)粒，并在BL21(DE3)pLysS中進行融

4、合表達。SDSPAGE蛋白電泳和WesternBlot分析發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒在相對分子量29kDa處出現(xiàn)一條特異條帶，正好是標(biāo)簽蛋白TrxTag相對分子質(zhì)量(20kDa)與PolR2的成熟肽相對分子質(zhì)量(9kDa)的總和，與預(yù)期融合蛋白相對分子質(zhì)量相符，表明成功構(gòu)建了TrxPolRl融合蛋白重組原核表達系統(tǒng)，且大部分以可溶性蛋白形式存在，為進一步從分子水平探討新基因PolRI成熟肽的研究奠定了基礎(chǔ)。3牙鲆免疫相關(guān)基因2(Polivaceusi

5、mmulaerelatedgene2，PolR2)的克隆及分析通過DDPCR和RACE技術(shù)，拼接得到了長度為1061bp的牙鲆免疫相關(guān)基因2(EU224372)全長cDNA，其中5’UTR為169bp，ORF為336bp，3UTR為556bp，可編碼1l1個氨基酸，預(yù)測的分子量約為1384KD，等電點為8Ol?；蚪MDNA序列共含有5個內(nèi)含子，6個外顯子。編碼的蛋白含有一個26個氨基酸組成的信號肽，為分泌型蛋白。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對后并