人抗病毒基因-MxA轉(zhuǎn)染細(xì)胞株-NIH-3T3的建立及抗VSV病毒效應(yīng).pdf

1、構(gòu)建人的抗流感病毒基因-MxA(Myxovirus resistance protein A)克隆真核表達(dá)載體pEGFP-C1，再將pEGFP-C1-MxA轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞，通過(guò)G418抗性結(jié)合綠色熒光篩選出雙陽(yáng)性細(xì)胞克隆，用本室制備的鼠抗MxA蛋白血清，對(duì)上述的細(xì)胞克隆進(jìn)行Immunoblot分析和細(xì)胞免疫熒光/細(xì)胞免疫化學(xué)分析，并用RT-PCR技術(shù)對(duì)上述細(xì)胞中的MxA特異性序列進(jìn)行分析鑒定，再用標(biāo)準(zhǔn)VSV病毒株攻擊進(jìn)行抗病毒效

2、應(yīng)試驗(yàn)。結(jié)果顯示：pEGFP-C1-MxA轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞經(jīng)G418抗性和綠色熒光蛋白篩選并經(jīng)二輪亞克隆篩選了3個(gè)雙陽(yáng)性細(xì)胞克隆(1.4.5,4.3.6,3.2.16)和EGFP基因轉(zhuǎn)染克??；以MxA基因與鼠Mxl基因非同源區(qū)的序列設(shè)計(jì)的特異的引物進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)三株均顯陽(yáng)性，Immunoblot分析三株細(xì)胞表現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示上述三株細(xì)胞有大于98％的細(xì)胞表現(xiàn)為強(qiáng)陽(yáng)性。VSV抗性試驗(yàn)表明：在感染50 PFU(p

3、lague formation Units)/孔的VSV后，在(4.3.6,3.2.16)細(xì)胞株均未發(fā)現(xiàn)空斑，而(1.4.5)細(xì)胞克隆中只出現(xiàn)少量空斑，對(duì)照組中出現(xiàn)大量的空斑。在0.001 TCID50 VSV對(duì)細(xì)胞感染48h后病毒產(chǎn)量分別是(4.3.6，3.2.16,1.4.5)3.5X103和4,8X1O3和5.3X105而對(duì)照組中病毒產(chǎn)量為3.5X106。三株細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗VSV活性(TCID50提高了1000X)。上述的結(jié)果