不同肢端畸形中HOXD13、TNNI2和TPM2基因的突變鑒定.pdf

1、先天性肢端畸形是人類最常見的出生缺陷之一，在新生兒中的發(fā)生率為1‰-2‰。引起先天性肢端畸形的原因有環(huán)境因素和遺傳因素兩大類。環(huán)境因素主要包括病毒感染、電離輻射、化學致畸劑、不良的子宮內(nèi)環(huán)境和母體的代謝性疾病等，例如，孕婦在妊娠早期服用反應停所導致的海豹肢就是環(huán)境因素引起肢端畸形的典型示例。遺傳因素主要指基因突變或染色體畸變，其導致的肢端畸形既可單獨發(fā)生又可是某種綜合征的一部分。多種基因突變和染色體畸變都會直接引起肢端形態(tài)發(fā)生(morp

2、hogenesis)的異常，表現(xiàn)不同類型的肢端畸形，如并指(趾)、短指(趾)和缺指(趾)(ectrodactyly)畸形屬于形態(tài)發(fā)生不完全的結果，多指(趾)畸形則是形態(tài)發(fā)生過程中附加組織形成的結果。而以遠端關節(jié)攣縮畸形(distal arthrigryposis，DA)為代表的另一大類肢端畸形，其直接原因并不是形態(tài)發(fā)生的異常，而是關節(jié)、肌肉等功能缺陷的繼發(fā)表現(xiàn)。本文利用分別屬于上述兩大類肢端畸形的五個中國人家系為研究對象，進行了致病基因

3、染色體定位、基因突變鑒定和突變基因功能初步分析等系列研究工作。 論文一 并指(趾)和短指(趾)畸形中日HOXD13基因突變研究 SD是由于指(趾)間骨性或軟組織融合形成的肢端畸形。BD是由于指(趾)骨和掌(跖)骨短小、缺失或融合導致的手足短小畸形。同樣，SD和BD既可單獨發(fā)生又可是某種綜合征的一部分。根據(jù)受累部位的解剖學特征，非綜合征型SD可分為Ⅰ-Ⅴ五種類型，非綜合征型BD被分為A-E五種類型。其中，BDA和BDE又可

4、分為若干亞型。現(xiàn)已知，HOXD13和GJA1分別是Ⅱ型和Ⅲ型SD的致病基因。IHH、BMPR1B、ROR2和GDF5基因突變分別可致BDA1、BDA2、BDB和BDC。同時，攜帶GDF5基因突變的個體也可表現(xiàn)BDA2。HOXD13基因含2個外顯子，編碼蛋白包括335個氨基酸。其中，外顯子1編碼的蛋白N-端含一個由15個丙氨酸殘基組成的多聚丙氨酸(polyalanine)鏈，外顯子2編碼C-端的同源異形結構域(homeodomain,HD

5、)。Ⅱ型SD又稱并多指(趾)(synpolydactyly，SPD)，由HOXD13基因多聚丙氨酸延展(polyalanine expansion，PAE)等突變引起。HOXD13基因點突變引起HD內(nèi)氨基酸替代時可導致BDD和BDE。因此，HOXD13單一基因內(nèi)不同突變可以是不同類型肢端畸形發(fā)生的遺傳基礎。本文在三個肢端畸形大家系進行了HOXD13基因致病基因的鑒定研究。 家系1中患者手部畸形特征表現(xiàn)為4-5掌骨融合，其它主要表

6、現(xiàn)為2-5指尺側偏位及遠節(jié)指骨短小、3-4或4-5并指、第5指短小或彎曲、屈指和中遠指節(jié)間關節(jié)褶消失；足部畸形共同表現(xiàn)為：趾骨外翻，跖骨內(nèi)翻，第1趾(跖)骨粗大，第2-5趾 (跖)骨發(fā)育不良，第5趾(跖)骨短。以上手足畸形表型與Robinow等報道的V型SD一致。家系2中患者畸形僅限于手足，手足骨骼普遍都縮短，屬于兼有BDA4，BDD和BDE表型的復合型BD。突出的表現(xiàn)是全部患者雙足2-5趾中節(jié)趾骨缺失，雙手2-5指中節(jié)指骨短小或與遠節(jié)

7、指骨融合，但以第5指、第2和5指中節(jié)指骨受累最多。部分患者拇指遠節(jié)指骨粗短；3-5掌(跖)骨全部或部分短小畸形；拇趾粗大、趾骨寬短；3-4指或2-3趾間軟組織輕度并指(趾)。家系3為一典型的SPD家系，患者主要臨床表現(xiàn)為3-4并指及4-5并趾，蹼中的第4指及第5趾部分或完全多指(趾)。 首先在染色體2q24.3-q31.3區(qū)段HOXD13基因內(nèi)部及基因兩側選取6個多態(tài)信息量高的微衛(wèi)星標記，采用LNKAGE軟件包中的MLINK程序

8、計算遺傳標記與致病基因所在的疾病基因座(disease locus)間的LOD值，對家系1進行兩點連鎖分析。結果表明：致病基因與上述微衛(wèi)星標記存在緊密連鎖關系，在D2S23 14標記獲得最大LOD值，為4.90(θ=0.00)。單體型分析顯示：家系1中SD表型與5個標記(D2S2981、HOXD13、D2S2314、D2S324和D2S1391)共分離。我們前期對家系2進行的兩點連鎖和單體型分析，己得到BD表型與3個標記(D2S2981

9、、HOXD13和D2S2314)共分離的數(shù)據(jù)資料。在此基礎上，我們通過PCR擴增HOXD13基因外顯子及外顯子／內(nèi)含子交界區(qū)，PCR產(chǎn)物直接測序或克隆測序，在上述三個家系中進行了致病基因突變鑒定研究。結果表明：三個家系中不同肢端畸形都由HOXD13基因的雜合突變所致。其中，V型SD家系中致病突變?yōu)閏.950A>G(p.Gln317Arg)，突變導致HOXD13蛋白HD內(nèi)第50位氨基酸由谷氨酰胺(Gin)變?yōu)榫彼?Arg)；復合型BD家

10、系中致病突變?yōu)閏.160 180delGCGGCGGCTGCGGCGGCGGCG(p．Ala54_Ala60del)，突變導致HOXD13蛋白7個丙氨酸(Ala)缺失，為多聚丙氨酸縮短(polyalanine contraction，PAC)；SPD家系中致病突變?yōu)閏．1 72_ 198dupGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCTGCG(p．Ala58-Ala66dup)，導致HOXD13蛋白9個Ala重復，屬于常見的PAE。

11、通過PCR產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶分析或／和PAGE分析驗證上述三種HOXD13基因突變，發(fā)現(xiàn)在相應的家系中突變見于全部患者而未見于正常家系成員。在100名和124名無關正常個體中分別檢測p．Gln317Arg和p.Ala54_Ala6Odel突變，結果均為陰性。特別值得提及的是，HOXD13蛋白第317位Gln是其結合DNA的關鍵氨基酸之一，迄今為止已知的HOX蛋白家族全部成員在HD第50位氨基酸都是Gin。以上結果和數(shù)據(jù)強烈提示，p．Gln

12、317Arg和p.Ala54_Ala6Odel兩種突變?yōu)橹虏⊥蛔儭Ｍㄟ^單體型分析和突變直接檢測，在家系1和3中分別完成了1例和2例高危胎兒的產(chǎn)前診斷。 總之，通過上述研究，我們發(fā)現(xiàn)了V型SD的致病基因，首次證明HOXD13基因PAC突變能引起B(yǎng)DA4／BDE／BDE畸形，首次在中國人SPD家系中檢測到HOXD13基因PAE突變。我們的研究結果為HOXD13基因突變相關肢端畸形表型譜增添了新的內(nèi)容。 論文二遠端關節(jié)攣縮畸形

13、中TNN13和TPM2基因突變研究 源于肌肉和關節(jié)等功能缺陷的先天性肢端畸形以遠端關節(jié)攣縮畸形(distalarthrogryposis，DA)最為常見，在新生兒中的發(fā)生率約為1／3000。DA患者主要臨床表現(xiàn)為對稱性或非對稱性的疊指、屈指、2-5指尺側偏位；馬蹄內(nèi)翻足、垂直距骨和扁平足等畸形。此外，DA還可伴隨顏面、身高、脊柱和皮膚紋理等異常。根據(jù)有無顏面等畸形，DA可分成10種亞型。其中，DA1為單純的手足關節(jié)攣縮畸形；DA2

14、A除手足關節(jié)攣縮畸形外還兼有微小嘴、“H”形頰窩、鼻唇褶明顯、人中長、小鼻子、瞼裂狹小、眼距寬大伴眼睛深陷和脊柱側凸等；DA2B表型介于DAl和DA2A之間，除手足關節(jié)攣縮畸形外，可有三角臉、瞼裂下斜和小嘴等顏面部表現(xiàn)。國外研究表明，編碼快速收縮肌纖維蛋白的三個基因TPM2(定位于染色體9p13)和TNNl2/TNNT3(定位于染色體11p15)的點突變可分別導致：DAl和DA2B。我們收集到兩個符合DA2B診斷標準的DA家系并進行了致

15、病基因突變鑒定研究。家系1為七代，包括32名患者，具有DA2B的典型手足和顏面表現(xiàn)，但家系內(nèi)患者表型變異明顯，3名患者有脊柱側凸(其中2名伴先天性髖脫位)。家系2三代共3名患者，1名患者有DA2B的典型的手足和顏面表現(xiàn)，其余2名患者僅有手足關節(jié)攣縮畸形，全部患者都表現(xiàn)身材矮小。我們首先通過UCSC人類基因組數(shù)據(jù)庫，在候選基因TPM2、TNNl2/TNNT3和TNNC2附近選擇微衛(wèi)星序列9p13AAC、llpl5CCT、11p15GI、和

16、20q13AC，自行設計PCR引物在家系中進行兩點連鎖分析和等位基因共享分析。在家系1中，11p15CCT顯示最大LOD值，在θ=O時為3.91，9p13AAC和20q13AC的LOD值在θ=O時都為-∞；在家系2中，僅9p13AAC存在等位基因共享，呈正LOD值(θ=O時為0.91)。以上結果提示：家系1中致病基因可能為TNNl2或TNNT3；家系2中致病基因可能為TPM2,，進一步在家系1中進行TNNl2基因編碼區(qū)的PCR擴增和測序

17、，發(fā)現(xiàn)一個涉及三個堿基的微小缺失突變，即c.523-525delAAG。該突變導致肌鈣蛋白I的175位賴氨酸缺失(p.Lysl75del)。家系中全部患者都攜帶此突變，而在正常家系成員和50名無關正常對照個體中都未檢測到此突變。通過NCBI/BLAST進行同源序列比對分析，發(fā)現(xiàn)175位賴氨酸為所有肌鈣蛋白I中高度保守的氨基酸。因此，我們認為c.523-525delAAG(p.Lysl75del)為致病突變。在家系2中進行TPM2基因測序

18、，發(fā)現(xiàn)所有患者為c.308A>G(p.Glnl03Arg)錯義突變的雜合子。通過PCR產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶分析驗證，確認正常家系成員和65名無關正常對照個體中均無此突變。同樣，TPM2基因c.308A>G(p.Glnl03Arg)突變改變了β-原肌球蛋白中高度保守的氨基酸。所以，該突變也應該為致病突變。 綜上所述，我們首次在中國人DA2B家系中檢出TNNl2基因致病突變，發(fā)現(xiàn)TPM2基因突變亦導致DA2B。本文在中國人DA2B家系中