天府肉羊TNNT1、TNNT2和TNNI2基因的克隆以及組織表達(dá).pdf

1、骨骼肌占產(chǎn)肉動(dòng)物軀體的40％，是動(dòng)物軀體中最重要的組成部分，也是影響肌肉品質(zhì)的重要因素之一，因而影響肉質(zhì)生產(chǎn)的骨骼肌基因是家畜分子育種工作中重要的候選基因。肌鈣蛋白I2型（TNNI2）基因和肌鈣蛋白T1（TNNT1）作為快骨骼肌基因，在動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，是影響動(dòng)物屠宰性能的重要功能基因;肌鈣蛋白T2（TNNT2）作為心肌亞型在影響心肌組織的正?；顒?dòng)方面具有很大的研究?jī)r(jià)值。
　　本研究運(yùn)用RT-PCR結(jié)合克

2、隆測(cè)序方法分別獲得了天府肉羊TNNT1、TNNI2和TNNT2基因的全編碼區(qū)序列。結(jié)果顯示:TNNT1基因CDS區(qū)長(zhǎng)度是759 bp，編碼252個(gè)氨基酸，得到的蛋白序列含有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，7個(gè)磷酸化位點(diǎn)，且該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)只具有α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，沒(méi)有延伸片段，提交NCBI獲得登錄號(hào):KF939315;TNNT2基因具有較長(zhǎng)的CDS區(qū)858 bp，編碼285個(gè)氨基酸，蛋白序列含有15個(gè)磷酸化位點(diǎn)和一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無(wú)

3、規(guī)則卷曲和α-螺旋，提交NCBI得到登錄號(hào)KF939316;克隆出天府肉羊的TNNI2基因，在NBCI數(shù)據(jù)庫(kù)中blast，發(fā)現(xiàn)CDS區(qū)長(zhǎng)度為549 bp，編碼187個(gè)氨基酸。得到的該蛋白序列有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，存在6個(gè)磷酸化位點(diǎn)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，序列提交NCBI獲得登錄號(hào):KF939314。
　　對(duì)天府肉羊TNNT1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示天府肉羊與牛屬、人屬、海豚屬、綿羊?qū)?、藏羚屬、八齒鼠屬、大熊貓屬

4、、豬屬、羊駝屬和貓屬的相似性則分別為94％、92％、93％、72％、85％、91％、92％、93％、93％和91％，在TNNTI基因與其他物種的進(jìn)化關(guān)系中，天府肉羊TNNT1基因與豬的關(guān)系最近，其次為綿羊、藏羚羊、八齒鼠和牛，家貓、雪貂和大熊貓分在一支，靈長(zhǎng)類(lèi)聚為一支;TNNT2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示天府肉羊與牛屬、人屬、水牛屬、長(zhǎng)臂猿屬、犀牛屬、犬屬、熊貓屬、豬屬、雪貂屬和貓屬的相似性分別為94％、88％、95％、88％、89％

5、、89％、89％、91％、88％和89％;在進(jìn)化關(guān)系中天府肉羊TNNT2基因與反芻動(dòng)物牛的關(guān)系最近，與人、黑猩猩和長(zhǎng)臂猿等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物聚為一支，然后與雪貂和熊貓聚為一支，豬和小須鯨聚為一支，狼和海象聚為一支;TNNI2氨基酸序列與海象、豬、大鼠、家兔、小鼠、人、荷蘭豬、牛、黑猩猩和海豚的相似性分別為97％、96％、96％、95％、94％、96％、94％、98％、92％和92％，構(gòu)建TNNI2氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，天府肉羊與牛的親緣關(guān)系

6、最近，其次為海象、人、豬與海豚的最遠(yuǎn)。
　　實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定天府肉羊的TNNT1、TNNT2和TNNI2基因在11個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明:TNNT1基因在肺臟中表達(dá)量最高，在心臟中表達(dá)量最低;在4個(gè)年齡階段中，365日齡肺臟中的表達(dá)量高于其他年齡段。TNNT2基因在心臟中高表達(dá)，其次為肝臟和肺臟，其他8個(gè)組織之間差異不顯著;在心臟中，TNNT2基因表達(dá)量隨日齡的增長(zhǎng)而增加。TNNI2基因在被檢測(cè)的11個(gè)組織

7、中，以腹肌中的表達(dá)量最高，其次為膈肌，在內(nèi)臟組織中表達(dá)量最低，檢測(cè)的肌肉組織中的相對(duì)表達(dá)量與內(nèi)臟組織的差異極顯著(P＜0.01);在1日齡、183日齡、365日齡和730日齡腹肌組織中，365日齡與其他日齡間的差異極顯著（P＜0.01）。
　　蛋白質(zhì)免疫印跡（Westren Bloting）分析TNNT1蛋白在天府肉羊365日齡齡時(shí)8個(gè)組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在8個(gè)組織中都檢測(cè)到信號(hào)，其中除膈肌信號(hào)弱外，其他都比較強(qiáng);在表達(dá)量