糖原累積病IXc型PHKG2基因新突變的鑒定和功能研究.pdf

1、背景：
　　糖原累積病IX型（Glycogen storage disease type IX,GSD IX）是磷酸化酶激酶缺陷導(dǎo)致的一組遺傳代謝疾病,是糖原累積病的常見類型。磷酸化酶激酶（Phosphorylase kinase,PhK）是由四個亞基α、β、γ和δ組成的全酶(αβγδ)4，是調(diào)節(jié)糖原分解和代謝的關(guān)鍵酶。GSD IX根據(jù)臨床和遺傳的異質(zhì)性分為四個亞型：IXa、IXb、IXc和IXd。
　　GSD IXc型（O

2、MIM613027）是PHKG2（OMIM172471）基因突變導(dǎo)致肝臟PhK的γ亞基缺陷的常染色體隱性遺傳病，是GSD IX型中的罕見類型。一般嬰幼兒期起病，表現(xiàn)為肝大、生長遲緩，肝酶升高、空腹低血糖、高乳酸血癥、代謝性酸中毒、高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥，肝纖維化和肝硬化風(fēng)險較高。目前GSD IXc型患兒治療主要是飲食治療和對癥處理，包括口服生玉米淀粉（uncooked cornstarch,UCCS)，定期監(jiān)測血糖。
　　P

3、HKG2基因位于染色體16p11.2，含10個外顯子，全長9.5kb，編碼406個氨基酸。在HGMD數(shù)據(jù)庫及文獻中已報道31種突變，未見突變熱點。
　　GSD IXc型臨床罕見，到目前為止全世界對該病的報道只有27例，其中多數(shù)來自于歐洲和美洲，亞洲沙特阿拉伯3例和日本2例，國內(nèi)尚無此病的報道和研究。自1996年Maichele等首次對PHKG2基因的gsd突變大鼠的進行研究報道之后，國外再無新突變體外功能學(xué)研究。本研究對1例GSD

4、 IXc型患兒進行臨床資料的回顧性分析和PHKG2基因檢測，總結(jié)臨床表型和基因?qū)W特征，并進行PHKG2基因新突變的功能學(xué)研究，可以進一步提高對該病的認識和明確PHKG2基因突變的致病性和分子發(fā)病機制，豐富了PHKG2基因突變的功能性研究，為疾病預(yù)后、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷建立基礎(chǔ)；同時提高了對γ亞基結(jié)構(gòu)的認識，為將來進一步研究PhK與其他物質(zhì)相互作用提供基礎(chǔ)，為GSD IXc型的新治療方案的探索提供有價值的信息。
　　目的：
　

5、　對GSD IXc型患兒的PHKG2基因突變進行鑒定，探討該病的臨床特征和PHKG2基因新突變的致病性；建立PHKG2基因體外瞬時轉(zhuǎn)染體系，探討突變蛋白的表達變化和致病性。
　　方法：
　　1.本研究對二代測序篩查出1例GSD IXc型患者的臨床資料進行回顧性分析。
　　2.對GSD IXc型患兒的PHKG2基因進行Sanger測序驗證。查找HGMD和已報道文獻證實突變是否已報道，查找SNP和千人基因組數(shù)據(jù)庫是否為多態(tài)

6、位點突變。
　　3.對新錯義突變進行12個物種突變點的氨基酸保守性分析，應(yīng)用SIFT、Polyphen-2軟件在線分析預(yù)測新的錯義突變的致病性。
　　4.使用PyMOL軟件對PHKG2基因新發(fā)錯義突變的蛋白三維結(jié)構(gòu)構(gòu)象進行預(yù)測。
　　5.提取患兒、生物學(xué)父母和同齡健康對照兒童全血總RNA，進行qRT-PCR檢測PHKG2基因的mRNA表達差異。
　　6.以表達增強型綠色熒光蛋白的質(zhì)粒p.cDNA3.1-EGFP為

7、空載體，構(gòu)建p.cDNA3.1-PHKG2-EGFP野生型質(zhì)粒，通過定點誘變成含新發(fā)突變位點、含已知致病突變位點和含一種多態(tài)位點的四種突變型質(zhì)粒，將上述質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入COS-1細胞，再采用qRT-PCR檢測細胞內(nèi)PHKG2基因的mRNA表達水平，采用免疫熒光法和Western blotting法檢測PHKG2蛋白蛋白表達情況，對2個新突變的致病性進行鑒定。
　　結(jié)果：
　　1.臨床資料：確診的1例GSD IXc型患兒新生兒期

8、起病，表現(xiàn)為肝臟腫大，肝酶升高，空腹低血糖，乳酸升高和代謝性酸中毒。無明顯體格生長遲緩，無血脂增高。
　　2.測序驗證：GSD IXc型患兒PHKG2基因存在復(fù)合雜合新突變：1個為錯義突變c.698T>C(p.Phe233Ser)，另一個為小插入突變c.957_958insGG(p.Gly319GlyfsX6)。
　　3.致病性預(yù)測：新發(fā)的錯義突變位點c.698T>C(p.F233S）在12個不同物種的氨基酸比對中提示高度保

9、守。對新發(fā)錯義突變F233S進行SIFT和Polyphen-2軟件預(yù)測分析，結(jié)果提示SIFT評分接近0，Polyphen-2評分接近1。
　　4.蛋白的晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測：新發(fā)錯義突變F233S改變了Loop上與其他氨基酸的連接，與H9的M241形成了不穩(wěn)定的氫鍵。
　　5.外周血qRT-PCR檢測：患兒PHKG2基因的mRNA表達水平顯著降低；患兒父母各自的mRNA表達水平顯著增高。
　　6.細胞體外功能表達檢測：

10、　　（1）qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)野生型和突變型的PHKG2基因mRNA表達水平均較空載組顯著升高，新發(fā)的錯義突變F233S組的mRNA水平較野生型組表達減少，插入突變組G319fsX表達未見減少。
　?。?）免疫熒光和Western blotting結(jié)果提示2種新突變的PHKG2蛋白表達較野生型減少。
　　結(jié)論：
　　1.本研究報道了國內(nèi)首例GSD IXc型病例，其臨床表現(xiàn)肝臟腫大，肝酶升高，空腹低血糖，和代謝性酸中毒

11、。
　　2.本研究發(fā)現(xiàn)PHKG2基因2種新突變c.698T>C(p.Phe233Ser)和c.957_958insGG(p.Gly319GlyfsX6)，豐富了PHKG2基因突變譜。
　　3.本研究首次對GSD IXc型患兒家系進行外周血PHKG2基因的mRNA表達比較分析，首次構(gòu)建含人PHKG2基因的p.cDNA3.1-PHKG2-EGFP質(zhì)粒和對2種新突變蛋白進行體外表達功能學(xué)鑒定。生物信息學(xué)和功能表達均提示2種新突變可