兩個(gè)肢端畸形家系致病基因的突變鑒定.pdf

1、先天性肢端畸形是新生兒最常見的出生缺陷之一，發(fā)生率約為1‰到2‰。遺傳物質(zhì)變異和發(fā)育過程中的不良環(huán)境因素（如病毒感染、化學(xué)藥物、電離輻射、異常的子宮內(nèi)環(huán)境等）是肢端畸形發(fā)生的兩大主要原因。多種基因突變和染色體畸變能直接導(dǎo)致肢端畸形發(fā)生，表現(xiàn)為指（趾）的數(shù)目、長度以及解剖形態(tài)的異常，如多指（趾）(polydactyly，PD)、缺指（趾）(ectrodactyly，ED)、短指（趾）(brachydactyly，BD)、并指（趾）(syn

2、dactyly，SD)等畸形。不同類型的肢端畸形可單獨(dú)發(fā)生，也可交叉存在，如并多指（趾）(synpolydactyly，SPD)、短并指（趾）等。研究先天性肢端畸形致病基因突變及其發(fā)生機(jī)制，有助于明確肢端發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)遺傳優(yōu)生和提供產(chǎn)前咨詢具有非常重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。本文以一個(gè)并多指（趾）畸形家系和一個(gè)手足裂畸形家系為研究對(duì)象，分別進(jìn)行了致病基因篩查和突變檢測(cè)，并對(duì)其中一個(gè)表型罕見的手足裂畸形家系的致病基因突變進(jìn)行了初步功能研

3、究。
　　 第一部分，并多指（趾）畸形家系HOXD13基因致病突變分析
　　 并多指（趾）畸形是一種罕見的常染色體顯性遺傳性肢端發(fā)育畸形，屬于非綜合征型Ⅱ型并指。典型臨床特征是手3、4指和足4、5趾并指（趾），有蹼相連，不能分離;伴或不伴骨性融合的蹼間存在部分或完全復(fù)制的額外的指（趾）。并多指（趾）畸形是一種具有高度臨床異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性的手足畸形，不同家系間或同一家系不同患者間或同一患者的手足畸形表現(xiàn)度及外顯率都存在顯

4、著差異?；颊呖蓡渭儽憩F(xiàn)為單手（足）或雙手（足）并指（趾）或并多指（趾），癥狀嚴(yán)重者可累及掌骨或跖骨，同時(shí)伴短指（趾）、屈指（趾）等指（趾）骨形態(tài)異常。據(jù)并多指（趾）畸形的遺傳異質(zhì)性，將其分為三個(gè)亞型:SPD1(MIM186000)、SPD2(MIM608180)和SPD3(MIM610234)，分別定位于染色體2q31、22q13.31和14q11.2-q12。
　　 HOX基因簇編碼的高度保守的同源盒轉(zhuǎn)錄因子家族，在脊椎動(dòng)物胚

5、胎肢端發(fā)育和形態(tài)發(fā)生中，將不同的定位信息傳送至肢體不同的部位，對(duì)機(jī)體的生長分化和其他生理過程具有重要的調(diào)控作用。HOXD13基因位于染色體2q31，是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的與人類肢端發(fā)育相關(guān)的HOX基因。HOXD13基因的四種突變類型可導(dǎo)致并多指（趾）畸形的發(fā)生:聚丙氨酸鏈延伸突變、缺失突變、無義突變和錯(cuò)義突變。其中，第一外顯子聚丙氨酸鏈延伸突變是導(dǎo)致大多數(shù)典型SPD發(fā)生的主要原因。本研究旨在探討山東一個(gè)典型并多指（趾）家系的表型及遺傳特點(diǎn)并對(duì)該

6、家系進(jìn)行致病基因篩查和突變分析。
　　 首先，對(duì)該并多指（趾）家系中疑診患者進(jìn)行詳細(xì)的臨床和影像學(xué)檢查明確診斷;然后據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選擇候選基因進(jìn)行突變檢測(cè)。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增HOXD13基因外顯子及側(cè)翼序列，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序和TA克隆測(cè)序檢測(cè)致病突變。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast分析軟件與GenBank提供的基因參考序列進(jìn)行比對(duì)，明確突變類型。最后在家系內(nèi)和群體中驗(yàn)證突變與該家系患者表型共分離，從而鑒定該家系的致病基因突變。

7、>　　 該并多指（趾）家系5代均有成員患病，無隔代遺傳現(xiàn)象，且男女均有發(fā)病，符合常染色體顯性遺傳特點(diǎn)。家系患者臨床表型復(fù)雜多樣，但都存在不同程度的并（多）指（趾）畸形，并多指（趾）診斷明確?；蚩寺〖皽y(cè)序結(jié)果表明家系中所有患者都攜帶HOXD13第一外顯子聚丙氨酸鏈編碼區(qū)24bp不完全三核苷酸重復(fù)序列的雜合插入突變，使聚丙氨酸鏈額外延伸了8個(gè)丙氨酸殘基，而在家系內(nèi)正常成員和60例正常漢族人群中均未發(fā)現(xiàn)該突變。
　　 本研究中并多

8、指（趾）家系患者表型差異大，呈常染色體顯性遺傳。HOXD13基因第一外顯子內(nèi)8個(gè)丙氨酸殘基的延伸突變與該家系患者的表型共分離，是該家系的致病基因突變。
　　 第二部分，利用外顯子組測(cè)序鑒定一手足裂畸形家系的致病基因
　　 手足裂畸形(split-hand/split-footmalformation，SHFM)是一種嚴(yán)重影響患者精細(xì)活動(dòng)的先天性肢端畸形，由肢端正中軸發(fā)育不全導(dǎo)致，典型臨床表現(xiàn)為手足中央縱向裂隙，伴缺指（趾

9、）、并指（趾）及端骨的發(fā)育不全，形似螯狀，也稱為缺指（趾）畸形。SHFM可以單獨(dú)發(fā)生（非綜合征型），也可合并其它系統(tǒng)異常（綜合征型）。SHFM具有高度遺傳異質(zhì)性，目前已定位的致病基因位點(diǎn)包括:SHFM1(MIM183600)、SHFM2(MIM313350)、SHFM3(MIM600095)、SHFM4(MIM605289)、SHFM5(MIM606708)和SHFM6(MIM225300)，分別位于染色體7q21、Xq26、10q24

10、、3q28、2q31和12q13，其中SHFM1、SHFM4和SHFM6位點(diǎn)的致病基因已經(jīng)明確，分別是DLX5基因、TP63基因和WNT10b基因。
　　 DLX5基因位于染色體7q21區(qū)域內(nèi)，屬于DLX同源盒基因家族，編碼轉(zhuǎn)錄因子家族成員，主要在胚胎早期發(fā)育中表達(dá)，調(diào)控脊椎動(dòng)物肢端發(fā)育和形態(tài)發(fā)生。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，DLX5基因具有類癌基因功能，在肺癌和淋巴瘤組織中高表達(dá)，可與MYC基因內(nèi)兩個(gè)不同的啟動(dòng)子位點(diǎn)結(jié)合，轉(zhuǎn)錄激活MYC基因表

11、達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　 我們?cè)谏綎|臨沂地區(qū)采集了一個(gè)SHFM家系，對(duì)家系患者進(jìn)行詳細(xì)的臨床和影像學(xué)檢查，明確診斷為非綜合征型SHFM。首先選取候選基因TP63進(jìn)行突變檢測(cè)，結(jié)果未見異常。然后對(duì)家系先證者進(jìn)行外顯子組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過人類基因組參考序列比對(duì)、數(shù)據(jù)庫篩查后，結(jié)合已定位遺傳位點(diǎn)內(nèi)的候選基因，對(duì)可疑變異進(jìn)行篩查發(fā)現(xiàn)，SHFM1位點(diǎn)DLX5基因第3外顯子內(nèi)存在一雜合錯(cuò)義突變。然后，通過直接測(cè)序，對(duì)家系患者及正常成員該突

12、變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該突變與疾病表型共分離;隨后在200名健康人群中進(jìn)行驗(yàn)證，也未發(fā)現(xiàn)該突變，說明該位點(diǎn)不是罕見多態(tài)，而是SHFM1致病突變。最后，利用人類DLX5基因野生型、突變型表達(dá)載體和MYC基因啟動(dòng)子熒光素酶表達(dá)載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，通過檢測(cè)熒光素酶表達(dá)活性分析突變基因?qū)YC基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DLX5突變基因調(diào)控MYC基因表達(dá)的功能顯著下降，進(jìn)一步證實(shí)該突變的致病性。
　　 本研究中SHFM家系三代8位成員中，共

13、有患者2例（女1例，男1例），符合常染色體顯性遺傳，外顯率完全。家系患者表現(xiàn)度差異不大，雙足均呈一致的典型正中裂畸形，雙手拇指發(fā)育基本正常，伴或不伴三節(jié)拇指畸形。DLX5基因c.5586＞T雜合突變?yōu)樵摷蚁抵虏⊥蛔?，先證者是家系中首發(fā)突變者。群體驗(yàn)證和熒光素酶表達(dá)活性檢測(cè)結(jié)果表明，該突變不是良性多態(tài)位點(diǎn)，而是SHFM1的致病突變。本研究首次發(fā)現(xiàn)DLX5基因突變導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性非綜合征型SHFM的發(fā)生，為進(jìn)一步研究疾病的發(fā)生機(jī)制奠定