PPARγ激動劑對Aβ降解酶——胰島素降解酶的作用及其機制的實驗研究.pdf

1、阿爾茨海默病(AD)是危害老年人健康的最常見癡呆。臨床治療現(xiàn)仍以乙酰膽堿酯酶抑制劑為主，療效不夠理想。Aβ是AD的致病元兇，其異常沉積是AD的病理學特征。近來學界認為，體內(nèi)Aβ失衡，也即Aβ過度生成或降解清除障礙是致其過度沉積的根本原因。針對Aβ，減少產(chǎn)生、促進降解、抑制聚集、加速清除是未來AD治療的主要方向。胰島素降解酶(IDE)作為重要的Aβ降解酶近年備受關(guān)注，對其表達或活性的調(diào)節(jié)將會是未來AD治療的新思路。2004年，Zhao 等

2、通過一系列體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)：IDE可能是胰島素信號通路下游的一個調(diào)節(jié)靶位，增強該通路可以上調(diào)IDE。而大量證據(jù)也提示，胰島素抵抗或胰島素信號轉(zhuǎn)導障礙隨著衰老的過程不斷進展，并參與了AD的發(fā)病。因此我們推論：增強胰島素信號通路，將不僅能糾正潛在的增齡相關(guān)胰島素抵抗，更可能通過增加IDE表達而加速Aβ降解，對AD發(fā)揮治療作用。 為驗證這一假設(shè)，本研究選用PPARγ激動劑這一胰島素增敏劑來增強胰島素信號通路，分別從體內(nèi)、外水平探討通過增

3、強胰島素信號通路、上調(diào)IDE進而促進Aβ降解的可能性。 第一部分 PPARγ激動劑上調(diào)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元TDE表達 目的 觀察體外水平上，PPARγ激動劑對IDE表達的影響，并與胰島素進行比較；選擇有效上調(diào)IDE的最佳干預(yù)劑及最適干預(yù)條件。 材料與方法 原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，接種后7-10天，以MAP-2免疫熒光染色鑒定純度。分別以胰島素 2、20、200 nmol/L，吡格列酮 0.01、0.1、

4、1 μmol/L，羅格列酮 0.01、0.1、1 μmol/L，及PBS 0.01mol/L處理6、12、24小時等不同的時間。以MTT比色法觀察細胞生存率，RT-PCR檢測IDE mRNA表達，Western blot檢測IDE蛋白水平的變化。 結(jié)果經(jīng)鑒定，原代海馬神經(jīng)元純度在95％以上。各不同濃度、時間、干預(yù)劑的處理均未降低細胞生存率。與PBS組相比，各濃度的胰島素(INS)、吡格列酮(PGZ)、羅格列酮(RSG)干預(yù)均能不

5、同程度地上調(diào)IDE mRNA表達，作用效應(yīng)呈劑量依賴性：處理6h，IDE mRNA表達的變化并不明顯；至12h，IDE mRNA表達明顯增高，高劑量組的增高程度更為突出；至24h，劑量依賴性表達上調(diào)趨勢進一步體現(xiàn)，其中以RSG 1 μmol/L的上調(diào)作用最為顯著。IDE蛋白表達的變化也有類似趨勢：處理6h，IDE輕度上調(diào)，RSG 1 μM組最為顯著；至12h，IDE顯著上調(diào)，仍呈劑量依賴性；至24h，亦基本延續(xù)了上述作用趨勢，但IDE蛋

6、白表達并無更為顯著地上調(diào)。各干預(yù)條件中，RSGl μM上調(diào)IDE的效應(yīng)最為顯著。本部分結(jié)果提示，INS、PGZ、RSG均能上調(diào)IDE表達，無論從mRNA水平和蛋白水平均是如此。后兩者的上調(diào)效應(yīng)與INS相當，甚至強于INS。同時，各組對IDE的表達上調(diào)均呈劑量依賴性，以RSG 1 μM作用最強。表達上調(diào)從干預(yù)6h開始，12h即已充分顯現(xiàn)。因此，選擇RSG 1 μM處理12h作為后續(xù)實驗的干預(yù)條件。 第二部分羅格列酮對Aβ?lián)p傷的神經(jīng)

7、保護及與IDE的關(guān)聯(lián) 目的 考察RSG對體外培養(yǎng)神經(jīng)元Aβ毒性的保護；初步探討該神經(jīng)保護效應(yīng)的作用途徑。 材料與方法 原代海馬神經(jīng)元接種7-10天，分別接受如下處理：Aβ40 5μM，Aβ40 5μM+RSG 1μM，A β42 1μM，Aβ 42 1μM+RSGlμM，Aβ42 1μM +RSG1μM + Wortmannin 50nM，Aβ42 1μM+RSG1μM+1，10-phenanthroli

8、nel0μM。處理12h后，觀察細胞形態(tài)學變化，以Hoechst33258染色、流式細胞計數(shù)檢測凋亡，MTT比色法檢測細胞生存率，Western-blot 測定 IDE，pAKT/tAKT，pGSK3β/tGSK3 β蛋白表達，ELISA測細胞培養(yǎng)上清液中A β 40、A β 42含量。 結(jié)果 Hoechst33258 染色結(jié)果顯示，A β 40、A β42 處理后凋亡細胞增多，而RSG 使凋亡比例顯著下降31.91％和30.7

9、9％(p<0.05)。流式細胞計數(shù)示，RSG使A β40、A β42處理后凋亡細胞分別減少39.15％和50.48％；使壞死細胞分別減少35.29％和20.30％(p<0.05)。MTT比色示，RSG使A β40、A β42處理后細胞生存率增加32.89％和43.91％(p<0.05)。RSG還可將Aβ40、42組的IDE蛋白分別上調(diào)168％(p<0.05)和150％(p<0.05)；將pAKT/tAKT比例上調(diào)123.33％(p<0.

10、01)和150％(p<0.01)，將pGSK3 β/tGSK3 β比例上調(diào)66.67％(p<0.05)和45.83％(p<0.05)。此外，RSG能使培養(yǎng)上清液中A β 40從4.56μM減少到3.65μM(p<0.05)，使Aβ42從0.90μM減少到0.67μM(p<0.05)。加入P13K抑制劑Wortmannin以后，RSG對A β 42組IDE、pAKT蛋白水平的上調(diào)作用明顯減弱，分別降低50％、57％(p<0.01)，凋亡細

11、胞顯著增多，從22.03％增至42.15％，上升91.33％(p<0.01)。加入IDE阻斷劑1，10-phenanthroline后，RSG對IDE及pAKT表達上調(diào)作用仍保持不變(p>0.05)，但凋亡細胞仍有所升高，增加57.92％ (p<0.05)。本部分結(jié)果提示RSG對Aβ40、Aβ42的神經(jīng)毒性均有保護作用，主要通過增強胰島素信號通路、上調(diào)IDE表達、促進Aβ降解來完成。 第三部分羅格列酮對增齡相關(guān)IDE下調(diào)

12、及AD樣模型大鼠的作用 目的 觀察增齡相關(guān)的IDE表達、活性及胰島素信號通路的變化，了解RSG可能的糾正作用；觀察RSG對Aβ制模AD樣大鼠的作用。 材料與方法 健康雄性SD大鼠，根據(jù)不同月齡和處理分為以下6組：3月齡，12月齡，18月齡，18月齡+RSG，18月齡+Aβ42，18月齡+Aβ42+RSG。青年大鼠(4m) 每組8只，老年大鼠(12、18m)每組12只。RSG，1mg/kg/天，每日晨單次灌

13、胃，連續(xù)給藥4個月。造模組雙側(cè)海馬CA3區(qū)立體定向注射Aβ42 10<'-4>M 5μ1。觀察各組大鼠的一般情況，以Morris水迷宮評定大鼠認知行為，Western-blot及免疫熒光染色檢測IDE、pAKT的表達，放射免疫法測定IDE活性，以ELISA測定腦內(nèi)Aβ水平。 結(jié)果 伴隨衰老的進展，大鼠認知功能進行性下降。Morris水迷宮測試3月齡組最佳(平均逃避潛伏期9.70s，18月齡組最差(27.80s)，12月齡

14、組介于二者之間(15.50s)，RSG干預(yù)的18月齡大鼠認知有所改善(14.60s)(p<0.05)?？臻g搜索試驗：與3月齡相比，12月齡的大鼠穿越平臺次數(shù)下降22.22％，p<0.05；18月齡組下降27.78％(p<0.01)；給予RSG后，穿越平臺次數(shù)較18m增加23.08％(p<0.05)。同時，IDE及pAKT表達隨月齡增長亦進行性減少。3m與12m兩組差異顯著，p<0.05，與18m間差異進一步擴大，p<0.01。18m大鼠

15、給予RSG4個月后，pAKT表達上調(diào)，IDE表達也相應(yīng)提高(與18m未服藥組相比，p<0.05)。IDE、pAKT免疫熒光染色也有類似改變(p<0.05)。IDE活性亦呈增齡相關(guān)，12m即已顯著下降至較低水平(p<0.01)。18m大鼠給予RSG干預(yù)能中等程度地上調(diào)肝臟IDE活性(p<0.05)，輕度上調(diào)腦組織IDE活性。RSG使Aβ42制模AD樣大鼠的認知損害部分減輕，逃避潛伏期由79.40s減至58.51s，降低26.31％，p<0

16、.05。Aβ42+RSG干預(yù)組的腦內(nèi)Aβ水平較低，從235.53pM降至187.34 pM，降低20.46％，p<0.05。 本部分研究提示，正常衰老的大鼠存在增齡相關(guān)的胰島素信號通路減弱、IDE下調(diào)及認知功能減退，隨衰老進展進行性加重。RSG能改善增齡相關(guān)胰島素信號通路障礙并在一定程度上逆轉(zhuǎn)IDE的表達和活性減低。在Aβ42制模AD樣大鼠中，RSG亦能減低腦內(nèi)Aβ42水平，改善認知。 1、以羅格列酮為代表的PPAR