PPAR-γ激動劑羅格列酮抗腦膠質(zhì)瘤作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　 通過細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)實驗探討過氧化物酶體增生物激活受體-γ(PPAR-γ)激動劑羅格列酮對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響。探討羅格列酮對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的影響，并觀察在羅格列酮作用下人膠質(zhì)瘤細(xì)胞粘附相關(guān)因子(ICAM-1，VCAM-1及E-selectin)在基因及蛋白水平表達(dá)變化，以探討其機(jī)制。觀察人膠質(zhì)瘤細(xì)胞TGF-β信號通路及其下游關(guān)鍵蛋白及基因的表達(dá)在羅格列酮作用下的變化，以闡明PPAR

2、-γ激動劑影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲性的分子機(jī)制及TGF-β信號通路在其作用中的重要性。
　　 研究內(nèi)容:
　　 1)研究不同劑量、不同作用時間下PPAR-γ激動劑羅格列酮對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87及U251增殖的抑制作用。
　　 2)觀察不同劑量、不同作用時間下羅格列酮對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87及U251凋亡以及細(xì)胞周期的影響。
　　 3)體外模擬膠質(zhì)瘤細(xì)胞在顱內(nèi)的缺氧狀態(tài)，觀察缺氧狀態(tài)下膠質(zhì)瘤

3、細(xì)胞侵襲性的改變及細(xì)胞粘附相關(guān)因子（ICAM-1，VCAM-1及E-selectin）表達(dá)改變。觀察在羅格列酮作用下人膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的改變，進(jìn)一步觀察粘附相關(guān)因子(ICAM-1，VCAM-1及E-selectin)在羅格列酮作用下表達(dá)變化，以闡明羅格列酮影響人膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的可能機(jī)制。
　　 4)觀察TGF-β通路中關(guān)鍵分子在羅格列酮作用下的表達(dá)改變，以進(jìn)一步探討PPAR-γ激動劑影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲性的

4、分子機(jī)制及TGF-β信號通路在其作用中的重要性。
　　 研究方法:
　　 1)MTT法檢測3μM，10μM，30μM羅格列酮在24h，48h，72h對U87細(xì)胞及U251細(xì)胞的增殖的抑制。
　　 2)用Annexin V-FITC及PI法檢測羅格列酮對人膠質(zhì)瘤U87及U251細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。
　　 3)體外模擬膠質(zhì)瘤細(xì)胞在顱內(nèi)的缺氧狀態(tài)，Western blot及RT-PCR檢測缺氧狀態(tài)下膠質(zhì)瘤

5、細(xì)胞細(xì)胞粘附相關(guān)因子（ICAM-1，VCAM-1及E-selectin）表達(dá)改變。Transwell法觀察在羅格列酮作用對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的影響，并用Western blot及RT-PCR法檢測粘附相關(guān)因子(ICAM-1，VCAM-1及E-selectin)在蛋白及基因水平表達(dá)變化。
　　 4)Western blot檢測在羅格列酮作用下U87細(xì)胞及U251細(xì)胞中TGF-β通路及其下游關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化，ELISA法檢測人膠質(zhì)

6、瘤細(xì)胞TGF-β分泌情況，western blot檢測TGF-β受體及其下游蛋白的表達(dá)、磷酸化水平，用免疫熒光成像觀察該通路中Smad3/Smad4復(fù)合物的形成。
　　 結(jié)果:
　　 1)羅格列酮作用24h、48h及72h，U87和U251細(xì)胞增殖出現(xiàn)不同程度的抑制，這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，高劑量組在作用相同時間下抑制率明顯大于低劑量組。
　　 2)在羅格列酮的影響下U87及U251細(xì)胞G1期細(xì)胞比例明顯增加

7、，而S期及G2/M期細(xì)胞比例明顯降低。羅格列酮能夠明顯降低增殖指數(shù)。隨著羅格列酮濃度的增加凋亡細(xì)胞的比例不斷增加。
　　 3)隨著羅格列酮劑量的升高，U87及U251細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)明顯下降。羅格列酮劑量達(dá)30μM時細(xì)胞遷移數(shù)明顯低于10μM組。膠質(zhì)瘤在腦組織的自然演進(jìn)過程中常處于缺氧狀態(tài)，缺氧狀態(tài)下膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)粘附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-selectin)的表達(dá)上調(diào)，羅格列酮的應(yīng)用能明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞粘附分子的表達(dá)

8、。
　　 4)U87及U251在羅格列酮作用下TGF-及TGF-βR2表達(dá)均下降，并且羅格列酮的這種抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴。U87細(xì)胞及U251細(xì)胞的TGF-β的分泌量在羅格列酮作用下顯著下降。羅格列酮作用下Smad3磷酸化水平明顯下降，并且羅格列酮的這種抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴。羅格列酮治療后U87和U251細(xì)胞中的Smad3和Smad4復(fù)合物形成顯著下降。在沒有接受羅格列酮治療的U87及U251細(xì)胞中，Smad3/Sm

9、ad4以復(fù)合物形式多見。在羅格列酮的作用下P-21及C-myc表達(dá)均下降。
　　 結(jié)論:
　　 1) PPAR-γ激動劑羅格列酮能顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。這種抑制作用是具有劑量、時間依賴性的。羅格列酮劑量越大、作用時間越長抑制率越高。羅格列酮對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制是通過促進(jìn)其凋亡、誘導(dǎo)其細(xì)胞周期停滯實現(xiàn)的。
　　 2) PPAR-γ激活劑羅格列酮對膠質(zhì)瘤U87及U251細(xì)胞的侵襲性有明顯的抑制作用。膠質(zhì)瘤在

10、腦組織的自然演進(jìn)過程中常處于缺氧狀態(tài)，缺氧狀態(tài)下膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)粘附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-selectin)的表達(dá)上調(diào)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)粘附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-selectin)的表達(dá)下降，可能是PPAR-γ激活劑羅格列酮抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的重要原因。
　　 3) TGF-β/Smad3信號通路可能是羅格列酮抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，可為羅格列酮在膠質(zhì)瘤治療中的臨床應(yīng)用提供理論支持及實驗