PEG修飾對(duì)PAMAM樹(shù)狀大分子導(dǎo)致細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)理.pdf

1、聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子（PAMAM）是一類由中心向外對(duì)稱發(fā)散且高度分枝的納米級(jí)高分子化合物，分子內(nèi)部的空腔可以用來(lái)包裹藥物分子，而末端得基團(tuán)可以通過(guò)修飾連接配體、抗體等生物活性物質(zhì)，分子所帶的高密度正電荷可以壓縮DNA。
　　 PAMAM 樹(shù)狀大分子現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，如基因載體、藥物載體、磁共振成像對(duì)比劑等。雖然PAMAM 樹(shù)狀大分子的應(yīng)用研究已取得了快速發(fā)展，但整代PAMAM 樹(shù)狀大分子表面有大量氨基基團(tuán)，在生理pH條

2、件下易質(zhì)子化而帶正電，因此不可避免的具有一定的細(xì)胞毒性。利用無(wú)毒、水溶性好的免疫惰性大分子聚合物對(duì)PAMAM 進(jìn)行修飾是降低毒性、提高生物相容性的有效方法之一。本實(shí)驗(yàn)采用不同相對(duì)分子質(zhì)量（MW）的聚乙二醇（PEG）對(duì)五代（generation 5，G5）PAMAM進(jìn)行不同程度的修飾?？疾霵AMAM的細(xì)胞毒性和PEG 修飾的保護(hù)作用及其機(jī)理，探討PEG的相對(duì)分子質(zhì)量和修飾度對(duì)保護(hù)作用的影響，并研究PEG 修飾對(duì)樹(shù)狀大分子的細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)染能

3、力的影響。完成的主要工作有：
　　 (1)分別用相對(duì)分子質(zhì)量為2 k和5 k的mPEG-SC對(duì)G5 PAMAM 進(jìn)行兩種氨基取代度修飾，低取代度偶聯(lián)的PEG數(shù)為13、高取代度偶聯(lián)數(shù)為51，分別為G5PAMAM 表面氨基數(shù)的10%和40%。得到四種PEG-PAMAM 化合物，分別為13PEG-2k-PAMAM、51PEG-2k-PAMAM、13PEG-5k-PAMAM和51PEG-5k-PAMAM。
　　 用相對(duì)分子質(zhì)量為

4、20 k的mPEG-SC對(duì)G5 PAMAM 進(jìn)行修飾，偶聯(lián)的PEG數(shù)為13，得到13PEG-20k-PAMAM。用核磁波譜和紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。
　　 (2)應(yīng)用噻唑藍(lán)法（MTT）考察PAMAM對(duì)鼠成纖維細(xì)胞（NIH 3T3）的細(xì)胞毒作用，結(jié)果表明PAMAM的細(xì)胞毒性有濃度和時(shí)間依賴性。比較PAMAM與PEG-PAMAM的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)PEG 修飾后樹(shù)狀大分子細(xì)胞毒性顯著降低，13PEG-2k-PAMAM、51PEG-2k-P

5、AMAM和13PEG-5k-PAMAM 分別降低12、37和34 倍，毒性最小的51PEG-5k-PAMAM可以降低105 倍。
　　 (3)用FITC標(biāo)記PAMAM和PEG-PAMAM，考察細(xì)胞對(duì)樹(shù)狀大分子的攝取情況。結(jié)果表明，PAMAM可以被細(xì)胞快速攝取，PEG-2k 修飾對(duì)攝取過(guò)程沒(méi)有顯著影響，PAMAM、13PEG-2k-PAMAM和51PEG-2k-PAMAM與細(xì)胞孵育2 h后陽(yáng)性細(xì)胞率接近100%。相對(duì)分子質(zhì)量較大P

6、EG 修飾的13PEG-5k-PAMAM和51PEG-5k-PAMAM的攝取率雖然略低，但也達(dá)到了80%。此外，樹(shù)狀大分子細(xì)胞攝取過(guò)程有溫度依賴性，在低溫環(huán)境條件下攝取率明顯降低，說(shuō)明細(xì)胞對(duì)樹(shù)狀大分子的攝取是一個(gè)耗能過(guò)程。PAMAM和PEG-PAMAM 有核靶向力，與細(xì)胞孵育15 min后即開(kāi)始在核聚集。進(jìn)一步用綠色熒光蛋白（GFP）作為報(bào)告基因考察PAMAM和PEG-PAMAM的轉(zhuǎn)染能力。PAMAM和PEG-PAMAM 均能將GFP轉(zhuǎn)

7、運(yùn)至NIH 3T3細(xì)胞并成功表達(dá)。調(diào)整13PEG-2k-PAMAM和51PEG-2k-PAMAM 復(fù)合物中的電荷比，可以得到與PAMAM 相似的轉(zhuǎn)染效果。
　　 (4)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、熒光分光光度法考察細(xì)胞凋亡、胞內(nèi)ROS含量和線粒體膜電位的變化，發(fā)現(xiàn)PAMAM誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS的增加，損傷細(xì)胞膜及線粒體膜，引起線粒體跨膜電位的降低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與PAMAM 相比，PEG 修飾的樹(shù)狀大分子在較高濃度時(shí)才會(huì)引致細(xì)胞凋亡，而且凋亡率

8、明顯下降。此外，PEG 化可明顯抑制胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和蓄積，維持線粒體膜電位穩(wěn)定，保護(hù)線粒體。說(shuō)明PEG 化是通過(guò)拮抗胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷而降低PAMAM的細(xì)胞毒性的。偶聯(lián)的PEG 鏈越多、偶聯(lián)的PEG 相對(duì)分子質(zhì)量越大，毒性下降的越明顯。
　　 (5)以人紅細(xì)胞考察PAMAM、13PEG-2k-PAMAM、13PEG-5k-PAMAM和13PEG-20k-PAMAM的血液相容性。紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 mg/mL PAMAM的平

9、均溶血率達(dá)到7.67±2.25%，13PEG-2k-PAMAM、13PEG-5k-PAMAM和13PEG-20k-PAMAM的平均溶血率在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均小于5%，低于PAMAM組溶血率（P<0.05）。用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAMAM和13PEG-2k-PAMAM 能夠引起紅細(xì)胞聚集，而13PEG-5k-PAMAM和13PEG-20k-PAMAM與紅細(xì)胞作用后細(xì)胞仍維持正常形態(tài)，保持良好的懸浮性。用原子力顯微鏡（AFM）觀

10、察紅細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)PAMAM和13PEG-2k-PAMAM 處理后紅細(xì)胞變形，紅細(xì)胞膜被嚴(yán)重破壞，而13PEG-5k-PAMAM和13PEG-20k-PAMAM 處理的紅細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)與正常紅細(xì)胞接近，膜表面粗糙度遠(yuǎn)低于PAMAM 處理紅細(xì)胞。說(shuō)明PEG的相對(duì)分子質(zhì)量會(huì)對(duì)樹(shù)狀大分子的血液相容性產(chǎn)生較大影響，相對(duì)分子質(zhì)量較大的PEG 修飾的樹(shù)狀大分子血液相容性較好。
　　 綜上所述，PAMAM細(xì)胞毒性的產(chǎn)生主要是通過(guò)誘