利塞膦酸鈉抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化并通過逆轉(zhuǎn)RANKL-OPG的表達(dá)抑制破骨細(xì)胞分化.pdf

1、背景:
　　 骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞為特點(diǎn)，并導(dǎo)致骨脆性增加及易引起骨折的一類疾病。骨質(zhì)疏松癥波及全球約200，000，000人口，給家庭及社會帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。國際骨質(zhì)疏松基金會(IOF)的資料顯示，34％的絕經(jīng)后婦女及20％的老年男性罹患此病。骨質(zhì)疏松癥所致的骨折及其嚴(yán)重并發(fā)癥導(dǎo)致死亡率正逐年上升。
　　 骨質(zhì)疏松癥及老年性骨量減少，在骨量減少的同時(shí)通常伴隨著骨髓內(nèi)脂肪組織的增多。實(shí)際上，骨髓內(nèi)脂肪

2、的異常增多在所有骨丟失性疾病上均有體現(xiàn)，如去勢后骨質(zhì)疏松、廢用性骨質(zhì)疏松及糖皮質(zhì)激素引發(fā)的骨質(zhì)疏松。如今，脂肪組織的功能已不再被認(rèn)為是單純的能量儲存及空間填充作用，它可以作為內(nèi)分泌器官，分泌各種細(xì)胞因子及激素，參與骨代謝活動。骨髓內(nèi)的脂肪細(xì)胞有望成為骨質(zhì)疏松癥診斷、預(yù)防及治療的新靶點(diǎn)。
　　 骨組織的穩(wěn)態(tài)主要取決于骨吸收及骨形成的相互平衡。起骨吸收作用的主要細(xì)胞是破骨細(xì)胞。破骨細(xì)胞主要來源于單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，由單核細(xì)胞融合分化而

3、成。其分化和成熟依賴于巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、護(hù)骨素(OPG)及護(hù)骨素配體（RANKL）。OPG及RANKL主要來源于成骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞，對骨重建起著重要的作用。RANKL通過與表達(dá)于破骨細(xì)胞的細(xì)胞核因子-κB受體活化因子（RANK）結(jié)合，能夠刺激破骨細(xì)胞活化和增殖;OPG與RANK競爭結(jié)合RANKL，從而抑制骨吸收，防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生。RANKL/RANK/OPG軸的失衡是導(dǎo)致很多溶骨性骨異常吸收疾病的主要原因。
　

4、　 利塞膦酸鈉（RIS），是第三代雙膦酸鹽的代表，系含氮雙膦酸鹽，具有顯著的抗骨吸收作用，臨床療效好，安全性高，被廣泛應(yīng)用于抗骨質(zhì)疏松的治療。既往對抗骨質(zhì)疏松藥物的研究往往局限于破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞本身，其對骨髓內(nèi)含量最豐富的脂肪組織的影響及機(jī)制的研究尚未明確。
　　 目的:
　　 本文通過細(xì)胞試驗(yàn)，探討了利塞膦酸鈉對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化過程中產(chǎn)生的RANKL/OPG的變化，及對破骨細(xì)胞的影響，為闡明利塞膦酸鈉防治

5、骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 本研究旨在通過分子、細(xì)胞探討利塞膦酸鈉抑制脂肪細(xì)胞分化，并通過OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生成。用RT-PCR，ELISA和Western blotting等生物學(xué)技術(shù)，從基因及蛋白表達(dá)水平，研究利塞膦酸鈉對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響，及其表達(dá)的RANKL/OPG的情況，研究其相應(yīng)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，并對其相關(guān)的分子作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

6、>　　 結(jié)果:
　　 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有體外成脂、成骨雙向誘導(dǎo)分化能力
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為多能干細(xì)胞的成脂、成骨雙向分化能力的證實(shí)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)2周后，胞漿內(nèi)大量脂滴形成。PPARγ特異性表達(dá)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)3周后，經(jīng)茜素紅染色可見細(xì)胞表面及胞漿內(nèi)大量鈣結(jié)節(jié)形成。
　　 2、利塞膦酸鈉濃度依賴性抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化
　　 利塞膦酸鈉呈濃度依賴性抑制人骨髓

7、間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化。不同濃度的利塞膦酸鈉（1～25μmol/L）作用于成脂誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，成脂率(ADpencent)呈濃度依賴性下降(P＜0.05)。
　　 3、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化時(shí)RANKL/OPG表達(dá)上調(diào)
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化2周。Westen Blot結(jié)果顯示:RANKL蛋白表達(dá)顯著升高，OPG蛋白表達(dá)無顯著變化，RANKL/OPG顯著升高(P＜0.05)。
　　 4、利塞

8、膦酸鈉逆轉(zhuǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化過程中RANKL/OPG的表達(dá)
　　 利塞膦酸鈉在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化過程中呈濃度依賴性抑制RANKL水平的表達(dá)。Westen Blot結(jié)果顯示:與對照組相比，不同濃度的利塞膦酸鈉（1～25μmol/L）分別作用于成脂誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利塞膦酸鈉呈劑量依賴性抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂過程中RANKL/OPG的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 5、利塞膦酸鈉對未成脂誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干

9、細(xì)胞表達(dá)的RANKL/OPG蛋白表達(dá)無影響
　　 未成脂誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以利塞膦酸鈉進(jìn)行干預(yù)。Westen Blot結(jié)果顯示:利塞膦酸鈉不能影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞RANKL/OPG表達(dá)。
　　 6、利塞膦酸鈉抑制脂肪細(xì)胞來源的炎癥因子分泌
　　 ELISA結(jié)果顯示:濃度為10μmol/L的利塞膦酸鈉干預(yù)成脂誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞36h后，與對照組相比，IL-1、TNF-α表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，IL-

10、6的表達(dá)也有下降，但與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 7、利塞膦酸鈉抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化時(shí)m TORC1信號通路被抑制。
　　 Westen Blot結(jié)果顯示:與對照組相比，成脂誘導(dǎo)、利塞膦酸鹽干預(yù)24h的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的PS6表達(dá)受到顯著抑制。
　　 結(jié)論:
　　 通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，利塞膦酸鈉可以通過下調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的脂肪細(xì)胞RANKL/OPG及炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的分化，