PEMF調(diào)控Ca2+-Calcineurin-NFATc1信號通路抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化.pdf

1、目的:
　　本文首先進行體外研究，采用小鼠單核/巨噬細胞系RAW264.7細胞構(gòu)建細胞模型，添加細胞核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator for nuclearfactor-kappa B ligand，RANKL)為刺激條件，誘導(dǎo)其向破骨細胞分化，因為體外實驗具有直接可控的優(yōu)點，嘗試闡明下述問題:第一，PEMF可否對RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7破骨分化的過程產(chǎn)生抑制作用;第二，RAW264.7細胞

2、內(nèi)鈣離子信號在PEMF影響下的變化情況;最后，依據(jù)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)理論，討論RAW264.7細胞向破骨細胞分化過程中PEMF的作用靶點，是否與抑制Ca2+-Calcineurin-NFATc1細胞信號通路有關(guān)。
　　方法:
　　1.實驗設(shè)計與分組
　　分別設(shè)置空白對照組（Control），RANKL單獨誘導(dǎo)組(RANKL)，低頻脈沖電磁場單獨照射組(PEMF)，RANKL誘導(dǎo)組+低頻脈沖電磁場(RANKL+PEMF)，RA

3、NKL誘導(dǎo)組+硝苯地平（RANKL+Nife），RANKL誘導(dǎo)組+內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放阻斷劑(RANKL+SKF-96365)，RANKL誘導(dǎo)組+他克莫司（RANKL+FK506），RANKL誘導(dǎo)組+低頻脈沖電磁場+硝苯地平(RANKL+PEMF+Nife)，RANKL誘導(dǎo)組+低頻脈沖電磁場+他克莫司(RANKL+PEMF+FK506)檢查不同組破骨分化特異型標志物、基因、蛋白及鈣離子表達;
　　2.實驗內(nèi)容
　　2.1 PEMF對

4、RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細胞向破骨細胞分化的影響
　　2.1.1 PEMF對RAW264.7細胞生物學(xué)特性的作用
　　應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測LEPMF(50Hz，1mT)對RAW264.7細胞分化過程中的影響。
　　2.1.2 破骨細胞分化基因蛋白的表達與檢測
　　傳代培養(yǎng)RAW264.7細胞，RANKL(50ng/ml)，PEMF（置于37℃，5％二氧化碳孵箱中照射3h/d）刺激4天。TRAP染色實驗

5、，骨片吸收陷窩實驗，Western blot以及RT-PCR檢測不同實驗條件下，破骨分化基因、蛋白以及特異性標志物的表達情況。
　　2.2 PEMF對RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細胞內(nèi)鈣離子信號的影響
　　鈣離子熒光探針Fluo4-AM(10μM)，標記RANKL刺激24h后的各組RAW264.7細胞，避光30min，激光共聚焦顯微鏡測定各組鈣離子變化情況。
　　2.3 PEMF對Ca2+-Calcineurin-

6、NFATc1破骨分化信號通路的調(diào)節(jié)
　　采用試劑盒測定Calcineurin蛋白活性，加入特異性信號通路阻滯劑后上述手段檢測鈣離子變化、Calcineurin蛋白表達，NFATc1核轉(zhuǎn)位情況及破骨分化特異性蛋白組織蛋白酶K的表達。
　　3.統(tǒng)計分析
　　數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，單因素方差分析(One-Way ANOVA)分析其余數(shù)據(jù)，方差齊性時采用LSD法

7、，方差不齊時采用Dunnett's T3法，組間兩兩比較采用t檢驗。設(shè)置P＜0.05表示為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.PEMF抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細胞向破骨細胞分化
　　1.1 CCK-8細胞增殖實驗
　　我們發(fā)現(xiàn)，各處理組在破骨分化過程的不同時間段對RAW264.7細胞的生存率影響無統(tǒng)計學(xué)意義(不同時間點F值分別為2.961、0.521、0.560、0.604/0.590，P值分別為

8、0.127、0.642、0.697、0.675、0.681)上述結(jié)果表明:RAW264.7細胞體外增殖活性不受PEMF干預(yù)，后續(xù)實驗的進行也在此基礎(chǔ)之上。
　　1.2 PEMF導(dǎo)致破骨分化相關(guān)基因蛋白及標志物的表達水平下降
　　我們觀察了破骨分化過程中2天和4天時，不同實驗組對RAW264.7細胞TRAP、MMP9、NFAT及CTSK基因及蛋白水平的影響，結(jié)果表明:與Control組比較，分化過程中2d和4d的WB和PCR顯

9、示，RANKL組各類破骨分化基因及蛋白的表達均顯著升高，而RANKL+PEMF組可以降低上述各類基因及蛋白的表達水平（F值及P值見表1-4、1-5）;各類蛋白在不同時間點之間的檢測結(jié)果證實，隨時破骨細胞分化過程的進行，其相應(yīng)基因及蛋白的表達均有增加，但并非均有顯著差異。TRAP染色檢測結(jié)果顯示:與RANKL組相比較，RANKL+PEMF組TRAP染色陽性細胞數(shù)目明顯減少，多核巨細胞數(shù)量少，TRAP活性低。（F=83.69，P＜0.000

10、1）骨片吸收陷窩面積測定結(jié)果顯示:RANKL+PEMF組骨片吸收面積較RANKL組顯著降低。(F=55.06，P＜0.0001)
　　2.PEMF抑制RAW264.7細胞內(nèi)鈣離子變化
　　在施加RANKL刺激24小時后的RAW264.7細胞，本文測定了不同實驗條件下細胞內(nèi)鈣離子變化的影響，結(jié)果顯示:與Control組比較，RANKL組能引起細胞內(nèi)鈣離子發(fā)生變化，產(chǎn)生鈣振蕩，PEMF組(0.322±0.012)可使細胞內(nèi)發(fā)生鈣

11、振蕩的細胞數(shù)比例顯著下降(F=40.62，P＜0.0001)然而RANKL+Nife（0.293±0.009）與RANKL+SKF-96365組(0.221±0.006)處理同樣可以產(chǎn)生PEMF的效果，使細胞鈣振蕩出現(xiàn)下降的趨勢，且三者之間無統(tǒng)計學(xué)差異，上述結(jié)果說明:PEMF對細胞內(nèi)鈣離子變化均有調(diào)控作用，但具體作用位點仍期待進一步探索。
　　3.PEMF抑制Ca2+-Calcineurin-NFATc1破骨分化信號通路
　

12、　在培養(yǎng)的RAW264.7細胞上，我們觀測了PEMF對Ca2+-Calcineurin-NFATc1破骨分化信號通路的影響，結(jié)果顯示:Calcineurin蛋白表達水平在不同處理組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(F=1.893，P=0.217)，但Calcineurin的活性檢測結(jié)果表明，與Control組相比，RANKL組顯著增高Calcineurin的活性，具有統(tǒng)計學(xué)差異(F=9.075，P=0.026)，但Calcineurin的蛋白水平僅具有

13、上升的趨勢，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。接著我們測定了NFATc1的細胞核轉(zhuǎn)位情況，結(jié)果顯示:RANKL組的胞質(zhì)c-NFATc1蛋白降低(F=27.38，P＜0.001)，具有統(tǒng)計學(xué)意義，而核蛋白n-NFATc1顯著增加（F=11.92，P=0.003）。PEMF組細胞的Calcineurin的活性及NFATc1蛋白轉(zhuǎn)位無顯著影響，但PEMF對RANKL誘導(dǎo)的Calcineurin的活性升高均有顯著的抑制作用。結(jié)果顯示:與RANKL組比較，RAN

14、KL+PEMF組的Caleineurin的活性降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。核蛋白n-NFATc1減少，胞質(zhì)蛋白c-NFATc1顯著升高。此外，在特異性信號通路阻滯劑作用下，結(jié)果表明:RANKL+Nife組與RANKL+FK506組較RANKL組，Calcineurin的活性及破骨分化蛋白表達水平均顯著降低（FCTSK=3.184，P=0.031;FNFATC1=9.682，P＜0.001），表明Ca+-Calcineurin-NFATc1

15、信號通路確實參與破骨分化，而二者加上PEMF刺激后，上述蛋白表達進一步出現(xiàn)下降趨勢，表明PEMF通過調(diào)控Ca2+-Calcineurin-NFATc1信號通路抑制破骨細胞分化。
　　結(jié)論：
　　1.體外環(huán)境下，PEMF可抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細胞向破骨細胞分化，并抑制其骨吸收作用。
　　2.PEMF可降低RAKKL活化的RAW264.7細胞內(nèi)鈣離子信號表達。
　　3.PEMF抑制Calcineuri