鴨疫里默氏桿菌脂多糖合成相關(guān)基因的鑒定及生物學(xué)特性分析.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)是一種可感染雛鴨、鵝、火雞等禽類后產(chǎn)生全身性敗血癥的重要致病菌。本病具有高發(fā)病率和高死亡率，廣泛分布于世界各地，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的主要成分之一，同時(shí)在大多數(shù)革蘭氏陰性菌中是一種重要的毒力因子，能夠影響細(xì)菌的致病力。本研究用RA脂多糖單克隆抗體對(duì)RA血清1型轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變庫(kù)進(jìn)行篩

2、選，獲得2株LPS突變株，生物學(xué)特性分析和動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明LPS O-抗原缺失后不僅會(huì)導(dǎo)致RA的致病力明顯下降，而且還會(huì)使RALPS突變株具有一定的交叉保護(hù)力。本研究包括以下2部分內(nèi)容:
　　一、本研究中，運(yùn)用間接ELISA方法篩選RA血清1型CH3菌株Tn4351轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變庫(kù)，試驗(yàn)結(jié)果表明有兩株突變株與RALPS單抗8A9均呈陰性反應(yīng)，分別命名為RA1067和RA1062。Southern-blot驗(yàn)證突變株RA10

3、67基因組中只有一個(gè)轉(zhuǎn)座子插入，序列分析顯示轉(zhuǎn)座子插入基因是M949_RS01915基因。qRT-PCR檢測(cè)M949_RS01915上下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)座子插入不影響M949_RS01915上下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，表明是M949_RS01915基因的失活導(dǎo)致突變株RA1067的生物學(xué)特性改變。通過(guò)測(cè)定該突變株LD50和血液載菌量，結(jié)果表明RA1067毒力較野生株CH3顯著下降，且易被機(jī)體所清除。血清殺菌試驗(yàn)證明RA1067對(duì)健

4、康鴨血清的敏感性明顯增強(qiáng)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，與野生株相比，RA1067共有19個(gè)差異表達(dá)基因，且差異表達(dá)倍數(shù)均大于5倍。qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證有2個(gè)基因上調(diào)大于3倍，3個(gè)基因下調(diào)大于3倍，功能分析結(jié)果表明上調(diào)基因主要參與新陳代謝和生物負(fù)調(diào)節(jié)過(guò)程，下調(diào)基因主要涉及新陳代謝和催化活性作用，其中編碼莢膜多糖合成蛋白CapD的M949_RS07580基因下調(diào)50倍，可能與莢膜多糖和脂多糖O-抗原合成相關(guān)。免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RA1067突變株

5、滅活疫苗可以有效保護(hù)血清1型W J4、血清2型Yb2、血清10型HXb2的攻毒，因此RA1067可以作為一株有交叉免疫保護(hù)的疫苗候選株。以上結(jié)果表明M949_RS01915基因參與鴨疫里默氏桿菌脂多糖O-抗原合成和基因的調(diào)節(jié)作用，且與致病性相關(guān)。
　　二、本研究中，根據(jù)之前間接ELISA試驗(yàn)的研究結(jié)果，獲得突變株RA1062。Southern-blot驗(yàn)證突變株RA1062基因組中只有一個(gè)轉(zhuǎn)座子插入，對(duì)其鑒定后發(fā)現(xiàn)突變基因是編碼C

6、PBP proteasefamily protein的M949_RS01035基因。序列分析結(jié)果顯示該基因?yàn)镽A血清1型和10型菌株所特有。Western-blotting試驗(yàn)結(jié)果表明RA1062 LPS與CH3相比，O-抗原部分的梯狀條帶明顯缺失。同時(shí)RA1062對(duì)雛鴨的致病力顯著下降、對(duì)血清的抵抗力也更為敏感。另外，我們同時(shí)制備RA1062滅活疫苗并進(jìn)行了疫苗的免疫效果評(píng)估試驗(yàn)，結(jié)果表明櫻桃谷鴨經(jīng)過(guò)二次RA1062滅活疫苗免疫后對(duì)血

7、清1型(WJ4)、和血清10型(HXb2)強(qiáng)毒攻擊產(chǎn)生100％的保護(hù)率，對(duì)血清2型(Yb2)強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)率也可達(dá)到75％。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，與野生株相比，突變株有12個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，9個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證有2個(gè)基因上調(diào)表達(dá)大于5倍，2個(gè)基因下調(diào)表達(dá)大于5倍，其中兩個(gè)上調(diào)基因M949_RS07300、M949_RS04680和一個(gè)下調(diào)基因M949_ RS03025編碼的蛋白都是TonB-dependent rece