肺炎支原體的感染、耐藥情況及其對(duì)阿奇霉素耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、肺炎支原體(Mp)是兒童和青少年社區(qū)獲得性呼吸道感染的常見(jiàn)病原體之一，支原體作為原核生物界中的最小微生物，結(jié)構(gòu)中無(wú)細(xì)胞壁，因此對(duì)作用于細(xì)胞壁的抗生素如青霉素類、頭孢類抗生素天然耐藥，而對(duì)影響細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的抗生素如四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類等敏感。由于藥物本身較大的不良反應(yīng)以及兒童處于生長(zhǎng)發(fā)育期等原因，四環(huán)素類、喹諾酮類藥物的使用受到一定的限制，目前臨床治療應(yīng)用最廣泛的藥物為大環(huán)內(nèi)酯類，如阿奇霉素。 國(guó)內(nèi)外檢測(cè)Mp方法很多，

2、目前主要包括經(jīng)典的培養(yǎng)法、血清學(xué)抗體檢測(cè)方法和核酸檢測(cè)方法等，但尚無(wú)令人滿意的、能準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)而又簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)Mp感染進(jìn)行診斷。因此，尋求更加適合臨床檢測(cè)要求的診斷方法顯得尤為重要。 本課題研究目的在于通過(guò)不同的檢測(cè)方法，調(diào)查本院社區(qū)獲得性呼吸道感染病人中Mp感染的情況，并且尋求更加適合臨床檢測(cè)要求的診斷方法，為肺炎支原體感染的臨床診斷提供依據(jù)。通過(guò)分離培養(yǎng)臨床的Mp菌株，了解本院Mp對(duì)抗生素耐藥情況，并結(jié)合體外誘導(dǎo)耐藥

3、的研究，檢測(cè)阿奇霉素對(duì)Mp作用靶位的基因突變情況，從而初步闡明Mp對(duì)阿奇霉素的耐藥機(jī)制，為臨床抗生素合理選擇和應(yīng)用提供理論指導(dǎo)，并對(duì)抗生素的改造和使用提供一定的理論依據(jù)。 對(duì)象和方法： 1、收集2007年8月至2008年3月本院呼吸科和兒科的住院、門(mén)診社區(qū)獲得性呼吸道感染病人(住院病人入院天數(shù)在2天以內(nèi))的咽拭子、痰標(biāo)本，床邊接種到肺炎支原體液體培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2環(huán)境培養(yǎng)5天，由紅變?yōu)辄S并且澄清判定為陽(yáng)性，

4、再轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行鑒定。采用CCU法測(cè)定菌株濃度，微量肉湯稀釋法進(jìn)行體外藥物敏感性測(cè)定，選用藥物為紅霉素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、洛美沙星、氯霉素。 2、2007年3月至2008年2月一年中，從呼吸科、傳染科、外科、兒科的住院和門(mén)診的社區(qū)呼吸道感染病人(住院病人入院天數(shù)在2天以內(nèi))抽取的血清作為臨床檢測(cè)標(biāo)本，應(yīng)用Serodia-Myco Ⅱ試劑盒檢測(cè)Mp-Ig M抗體，以單份血清抗體滴度≥1：320或者恢復(fù)期血清抗體升高4倍判

5、定為肺炎支原體感染。對(duì)年齡和不同季節(jié)進(jìn)行分組，采用卡方檢驗(yàn)的方法，對(duì)各年齡段和不同季節(jié)陽(yáng)性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 3、收集2007年8月至2008年3月本院呼吸科和兒科的住院、門(mén)診社區(qū)獲得性呼吸道感染病人(住院病人入院天數(shù)在2天以內(nèi))的咽拭子、痰標(biāo)本，床邊接種到肺炎支原體液體培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2環(huán)境培養(yǎng)24h，進(jìn)行PCR檢測(cè)，臨床標(biāo)本繼續(xù)培養(yǎng)4天，觀察培養(yǎng)結(jié)果。對(duì)病人年齡進(jìn)行分組，采用卡方檢驗(yàn)的方法，對(duì)各年齡段陽(yáng)性率進(jìn)行

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 4、收集2007年8月至2008年3月本院兒科和呼吸科住院的社區(qū)獲得性呼吸道感染患者(住院病人入院天數(shù)在2天以內(nèi))的痰或者咽拭子標(biāo)本，采用培養(yǎng)法、培養(yǎng)-PCR法檢測(cè)，并同時(shí)留取血清標(biāo)本做Mp-IgM抗體的檢測(cè)。采用卡方檢驗(yàn)的方法，對(duì)三種不同方法檢測(cè)Mp的陽(yáng)性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 5、使用PCR技術(shù)將FH標(biāo)準(zhǔn)株、對(duì)阿奇霉素敏感株和耐藥株Mp的23S rRNA V區(qū)基因、23S rRNA Ⅱ區(qū)基因、rplD基因、

7、rplV基因序列擴(kuò)增，測(cè)序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的Mp M1 29相應(yīng)基因作對(duì)比，檢測(cè)耐藥基因變異位點(diǎn)。 6、Mp體外誘導(dǎo)耐藥分析和耐藥機(jī)制研究：將藥敏試驗(yàn)中紅霉素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、洛美沙星所測(cè)得的Mp標(biāo)準(zhǔn)株亞抑菌濃度作為體外誘導(dǎo)耐藥的傳代生長(zhǎng)培養(yǎng)濃度，當(dāng)Mp對(duì)阿奇霉素的MIC達(dá)到耐藥水平時(shí)，檢測(cè)23S rRNA V區(qū)基因、23S rRNA Ⅱ區(qū)基因、rplD基因、rplV基因有無(wú)突變位點(diǎn)。 結(jié)果：

8、1、Mp的臨床分離、體外培養(yǎng)和藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果。 2007年8月至2008年3月呼吸科和兒科的門(mén)診、住院的社區(qū)獲得性呼吸道感染病人(住院病人入院時(shí)間在2天內(nèi))總共493例，年齡組成為6個(gè)月-79歲，取咽拭子、痰標(biāo)本進(jìn)行Mp培養(yǎng)，陽(yáng)性者4例，陽(yáng)性率為0.81％。通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離的4株Mp做藥物敏感試驗(yàn)可知，標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)紅霉素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、洛美沙星、氯霉素五種藥物均敏感，4株臨床分離株中，對(duì)紅霉素和阿奇霉素耐藥的有2株，它

9、們都對(duì)紅霉素高水平耐藥(MIC>=32 ug/ml)，對(duì)環(huán)丙沙星和洛美沙星耐藥的有3株，4株臨床株對(duì)氯霉素都敏感。存在多重耐藥情況，其中對(duì)兩種藥物耐藥的有1株，對(duì)四種藥物耐藥有2株。 2、肺炎支原體血清抗體測(cè)定結(jié)果。 2007年3月至2008年2月，呼吸科、傳染科、兒科的門(mén)診和住院2天以內(nèi)的社區(qū)獲得性呼吸道感染病人共1335例，病人年齡分布于5天-94歲，陽(yáng)性例數(shù)為36例，陽(yáng)性率2.70％。0-20歲組陽(yáng)性率(4.43％

10、)高于41-60歲組(0.56％)、61歲組以上組(0.53％)陽(yáng)性率(P<0.05)。21-40歲組陽(yáng)性率(3.65％)高于41-60歲組(0.56％)和61歲組以上組(O．53％)陽(yáng)性率(P<0.05)。對(duì)一年四季肺炎支原體血清抗體陽(yáng)性率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示各季節(jié)陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 3、培養(yǎng)-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)Mp的結(jié)果。 2007年8月至2008年3月我院呼吸科和兒科的住院、門(mén)診的社區(qū)獲得性呼吸道感染

11、病人(住院病人入院時(shí)間在2天內(nèi))共493例，患者年齡組成為6個(gè)月-79歲，檢測(cè)陽(yáng)性者10例，陽(yáng)性率2.03％。比較0-40歲(2.45％)和41-80歲(1.20％)陽(yáng)性率，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 4、三種不同方法檢測(cè)Mp的比較結(jié)果。 2007年8月至2008年3月我院呼吸科和兒科的社區(qū)獲得性呼吸道感染住院病人(入院時(shí)間在2天內(nèi))共148例，使用肺炎支原體血清抗體檢法檢測(cè)陽(yáng)性率11.49％，

12、培養(yǎng)-PCR法陽(yáng)性率6.76％。培養(yǎng)法陽(yáng)性的共4例，陽(yáng)性率2.70％。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，培養(yǎng)法與抗體法陽(yáng)性率、培養(yǎng)-PCR法與培養(yǎng)法陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，培養(yǎng)-PCR法與抗體法陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 5、對(duì)阿奇霉素耐藥基因變異位點(diǎn)分析結(jié)果。 與標(biāo)準(zhǔn)株M129株相比，對(duì)阿奇霉素耐藥的分離株2的23S rRNA的V區(qū)基因的2063位發(fā)生A到G的點(diǎn)突變，rplD基因出現(xiàn)162位C到A、430位A到G的點(diǎn)

13、突變， rplV基因出現(xiàn)279位T到C、508位T到C的點(diǎn)突變。對(duì)阿奇霉素耐藥的分離株3的rplV基因出現(xiàn)508位T到C的點(diǎn)突變，23S rRNA的V區(qū)基因、rplD基因未出現(xiàn)點(diǎn)突變。對(duì)阿奇霉素敏感的分離株1和4的23S rRNAv區(qū)基因、rplD基因、rplV基因均未出現(xiàn)點(diǎn)突變。FH標(biāo)準(zhǔn)株與分離株2的rplD基因均出現(xiàn)162位C到A、430位A到G的點(diǎn)突變， rplV基因也都出現(xiàn)279位T到C、508位T到C的點(diǎn)突變，但23S rRN

14、A的V區(qū)基因無(wú)點(diǎn)突變。所有菌株的23S rRNA Ⅱ區(qū)均未出現(xiàn)點(diǎn)突變。 6、Mp標(biāo)準(zhǔn)株(FH株)體外誘導(dǎo)耐藥及其藥敏分析結(jié)果。 使用紅霉素對(duì)Mp標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行體外耐藥誘導(dǎo)，第20代MIC值為0.64 ug/ml，使用阿奇霉素對(duì)Mp標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行體外耐藥誘導(dǎo)，第20代MIC值為0.0512ug/ml，檢測(cè)rplD基因、rplV基因、23S rRNA Ⅱ區(qū)基因、23S rRNA V區(qū)基因位點(diǎn)，均未出現(xiàn)點(diǎn)突變。 結(jié)論： 1、我

15、院存在肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類抗生素耐藥的菌株，并且有多重耐藥的現(xiàn)象。 2、使用血清抗體法對(duì)1335例社區(qū)獲得性呼吸道感染病人進(jìn)行檢測(cè)，肺炎支原體感染率為2.70％，青少年和兒童感染率高于其他年齡段。我院各季節(jié)的陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示各季節(jié)的發(fā)病呈散發(fā)，無(wú)明顯爆發(fā)現(xiàn)象。 3、使用培養(yǎng)-PCR法對(duì)493例社區(qū)獲得性呼吸道感染病人進(jìn)行檢測(cè)，肺炎支原體感染率為2.03％，0-40歲和41歲-80歲組陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

16、。 4、血清抗體法和培養(yǎng)-PCR法并用檢測(cè)肺炎支原體感染優(yōu)于單一檢測(cè)的方法。 5、 Mp對(duì)阿奇霉素耐藥的機(jī)制可能與23S rRNA V區(qū)基因的點(diǎn)突變相關(guān)，與23SrRNA Ⅱ區(qū)基因、rplD基因、rplV基因是否相關(guān)尚不能肯定。 6、Mp體外誘導(dǎo)耐藥的實(shí)驗(yàn)中，紅霉素和阿奇霉素的MIC值有升高的趨勢(shì)，但尚在敏感范圍內(nèi)，23S rRNA V區(qū)基因、23S rRNA Ⅱ區(qū)基因、rplD基因、rplV基因未發(fā)生點(diǎn)突變，尚