家蠅幼蟲抗菌肽作用于腫瘤細(xì)胞sup-b15的初步研究.pdf

1、目的：
　　利用家蠅幼蟲抗菌肽針對(duì)急性淋巴細(xì)胞瘤sup-b15進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明家蠅幼蟲抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞sup-b15有抑制作用。研究?jī)?nèi)容由三部分組成：1.對(duì)比研究家蠅幼蟲抗菌肽的分離純化物與粗提物對(duì)sup-b15的抑制效能；2.驗(yàn)證家蠅幼蟲抗菌肽聯(lián)合伊馬替尼對(duì)腫瘤細(xì)胞sup-b15是否具有增強(qiáng)抑制的作用；3.建立急淋白血病C57BL/6小鼠模型并探究家蠅幼蟲抗菌肽對(duì)其是否具有延長(zhǎng)生存期的作用。
　　方法：

2、　　通過(guò)針刺誘導(dǎo)、研磨、離心、C18柱固相萃取等方法制備家蠅三齡幼蟲抗菌肽粗提物，利用反相高效液相色譜儀（RP-HPLC）進(jìn)行分離純化，應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞抑制率，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其誘導(dǎo)凋亡的效果。
　　采用臺(tái)盼蘭拒染法，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率，利用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞并拍照。
　　選取健康的C57BL/6小鼠，經(jīng)環(huán)磷酰胺免疫抑制后，通過(guò)尾靜脈接種腫瘤細(xì)胞sup-b15，以此建立急淋白血病小鼠模型。對(duì)其實(shí)

3、施家蠅幼蟲抗菌肽干預(yù)后，觀察小鼠生存時(shí)間并繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算生命延長(zhǎng)率。利用全自動(dòng)血液檢測(cè)儀對(duì)小鼠外周血細(xì)胞記數(shù)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，然后進(jìn)行骨髓推片檢測(cè)并計(jì)算造模成功率。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一：利用反相高效液相色譜儀（RP-HPLC）分離純化得到8種純化物，按照蛋白含量增加（Increased）和新生成（Generate）分別標(biāo)記為I1、I2、I3、I4組和G1， G2、G3、G4組。家蠅幼蟲抗菌肽粗提物（Extra

4、cts）標(biāo)記為E0組。通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，8種純化物中有4種蛋白及粗提物（E0組）對(duì)sup-b15細(xì)胞有增殖抑制作用，細(xì)胞生存率均值分別為I1：71.4％、I2：78.5%、I4：64.1%、G2：68.6%、E0：56.1%。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果，其凋亡率均值分別為I1：16.73%、I2：9.79%、I4：18.60%、G2：11.85%、 E0：35.94%。
　　實(shí)驗(yàn)二：光學(xué)顯微鏡下分別觀察實(shí)驗(yàn)

5、組與對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，結(jié)果為：低倍鏡與高倍鏡下對(duì)照組的細(xì)胞增長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞密度大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；實(shí)驗(yàn)組觀察到的結(jié)果相對(duì)于對(duì)照組而言細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的增殖緩慢，密度減小，形態(tài)相對(duì)不完整。其中聯(lián)合用藥組抑制效果最為明顯，伊馬替尼組的抑制效果較抗菌肽組明顯。臺(tái)盼蘭染色后鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，細(xì)胞存活率分別為：對(duì)照組：（91.37±1.68）%；單一抗菌肽用藥組：（54.71±2.76）%；單一伊馬替尼用藥組：（38.04±1.55）%；伊馬替

6、尼抗菌肽聯(lián)合用藥組：（21.19±1.27）%。
　　實(shí)驗(yàn)三：實(shí)驗(yàn)初期（前4天）各組C57BL/6小鼠未出現(xiàn)明顯異常反應(yīng)。接種第5天后實(shí)驗(yàn)組小鼠生存質(zhì)量較對(duì)照組小鼠出現(xiàn)不同程度的下降，第8天開始實(shí)驗(yàn)小鼠出現(xiàn)死亡。各實(shí)驗(yàn)組中造模成功的C57BL/6小鼠生存時(shí)間分別為：實(shí)抗組12.52±1.39天；實(shí)對(duì)組10.9±1.59天；實(shí)P組10.8±1.97天。計(jì)算得知實(shí)抗組生命延長(zhǎng)率為13.15%。各實(shí)驗(yàn)組中造模成功的及對(duì)照組所有的C57B

7、L/6小鼠外周血進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)，結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組小鼠白細(xì)胞數(shù)量明顯增高，紅細(xì)胞及血小板數(shù)量明顯減少，對(duì)照組小鼠各血細(xì)胞數(shù)量正常。骨髓推片鏡下觀察到小鼠的有核細(xì)胞增生異?；钴S，原始淋巴細(xì)胞及幼稚淋巴細(xì)胞明顯增多，占有核細(xì)胞的比例大幅度上升，成熟的淋巴細(xì)胞相對(duì)較少，其余各系統(tǒng)細(xì)胞較正常情況明顯減少。實(shí)驗(yàn)組共有45只C57BL/6小鼠，其中造模成功的有13只，計(jì)算可得小鼠造模成功率為28.89%。
　　結(jié)論：
　　1.家蠅幼蟲抗菌肽