家蠅幼蟲抗菌肽defensin基因的克隆、表達、純化及抑菌、抑腫瘤活性研究.pdf

1、實驗?zāi)康?br>　　1.在實驗研究過程中我們對家蠅抗菌肽防御素(defensin)基因進行生物信息學(xué)的分析；并應(yīng)用分子生物學(xué)方法從家蠅幼蟲體內(nèi)提取抗菌肽防御素(defensin)基因，并對該基因進行克隆、表達與純化。
　　2.鑒定已純化的家蠅幼蟲抗菌肽防御素成熟肽(MD)部分對大腸桿菌E.coliK12D31的抑制作用；觀察抗菌肽防御素成熟肽(MD)對腫瘤細胞HepG2,SIHA,SW480和對人正常心肌細胞H9C2的抑制及殺傷作

2、用；比較該防御素成熟肽(MD)與羥基脲分別對肝癌細胞HepG2的作用效果。
　　3.觀察家蠅幼蟲抗菌肽防御素成熟肽(MD)對肝癌細胞HepG2細胞周期的影響；觀察家蠅幼蟲抗菌肽防御素成熟肽(MD)對肝癌細胞HepG2細胞凋亡的影響；觀察家蠅幼蟲抗菌肽防御素成熟肽(MD)對肝癌細胞HepG2凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的影響，從而探究抗菌肽防御素成熟肽(MD)殺傷肝癌細胞HepG2的作用機制與原理。
　

3、　實驗方法
　　我們對家蠅抗菌肽防御素(defensin)基因的主要特性進行生物信息學(xué)的分析。應(yīng)用蛋白質(zhì)分析專家系統(tǒng)（ExPASy）上的SOSUI、ProtParam、HNN、TMHMM、MotifScan和NCBI上的ORFfinder、Bcepred等生物信息學(xué)在線分析軟件進行分析，并結(jié)合DNAman、GeneRunner等生物信息學(xué)分析軟件進行分析、預(yù)測家蠅抗菌肽防御素defensin蛋白的可溶性及理化性質(zhì)、翻譯后修飾位點、

4、跨膜區(qū)、親（疏）水性、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及同源性分析，以及遺傳關(guān)系的比對等。
　　在Genbank中檢索家蠅defensin基因，根據(jù)其設(shè)計特異性引物，我們在家蠅幼蟲組織中提取RNA,并通過PCR聚合酶鏈反應(yīng)擴增defensin基因成熟肽部分(Maturedefensin,MD)，并將該基因與原核質(zhì)粒表達載體pGEX-6P-1進行質(zhì)粒重組，構(gòu)建家蠅抗菌肽重組蛋白pGEX-6P-1/MD。通過雙酶切鑒定證明目的片段已穩(wěn)定融合到載體p

5、GEX-6P-1中并將其轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，經(jīng)25℃IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌E.ColiDH5ɑ中表達，用GST-Sefinose親和層析純化蛋白，表達產(chǎn)物經(jīng)15％SDS-PAGE分析鑒定。
　　應(yīng)用四甲基偶氮噻唑藍(MTT)法求出不同濃度抗菌肽MD對SW480，SIHA，HepG2腫瘤細胞的抑制率及對人心肌細胞H9C2的抑制作用。用MTT法對不同濃度抗菌肽防御素作腫瘤細胞的生長曲線。采用MTT比色法分別求出不同濃

6、度抗菌肽防御素與羥基脲對肝癌細胞HepG2的抑制率，依據(jù)藥物濃度和抑制率用SPSS軟件求出防御素和羥基脲的半數(shù)抑制率(medianinhibitoryconcentration，IC50)和回歸方程。我們采用AnnexinV-Fitc-PI雙染凋亡檢測試劑盒檢測抗菌肽防御素MD，檢測它能否引起肝癌細胞HepG2的細胞凋亡。我們用流式細胞儀檢測抗菌肽防御素MD，觀察它對肝癌細胞HepG2細胞周期及凋亡的影響。本實驗室應(yīng)用caspase-3

7、檢測試劑盒與酶標測定儀檢測該蛋白caspase-3酶的活性。
　　實驗結(jié)果
　　我們通過生物信息學(xué)分析defensin蛋白由92個氨基酸組成，該蛋白的分子式為C435H670N126O124S9,它的分子質(zhì)量單位為9.9374ku，計算它的等電點理論值為8.75，檢測波長280nm時的吸光度（A）值為0.637，半衰期為30h，該蛋白具有4個翻譯后修飾位點。家蠅防御素與其他三種蠅科昆蟲防御素同源性較近。
　　以家蠅幼蟲

8、抗菌肽防御素成熟肽MD的cDNA為摸板進行擴增后獲得的堿基長度為142bp的defensin基因片段，本實驗成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-1/MD;之后菌液通過IPTG誘導(dǎo)后進行SDS-PAGE膠進行分析，實驗結(jié)果顯示了在大腸桿菌BL21（DE3）中防御素成熟肽MD基因片段高效表達，它的相對分子量（Mr）約30kDa。
　　本實驗抑菌實驗結(jié)果顯示家蠅幼蟲抗菌肽防御素對大腸桿菌E.coliK12D31有抑殺作用；我們用MTT法檢測

9、顯示六種不同濃度（30μg/ml,60μg/ml,120μg/ml,360μg/ml,680μg/ml,1000μg/ml）抗菌肽防御素MD對SW480，SIHA，HepG2腫瘤細胞均有不同程度的抑制作用，實驗結(jié)果與正常對照組比較結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；這六種不同濃度抗菌肽防御素對人心肌細胞H9C2均無較明顯抑制作用，其實驗結(jié)果與正常對照組相比較無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)；三種腫瘤細胞SW480，SIHA，HepG2在不同

10、濃度抗菌肽防御素MD作用下生長受到明顯抑制，防御素濃度和作用時間對細胞的抑制作用呈劑量反應(yīng)關(guān)系；經(jīng)計算防御素與羥基脲的回歸方程分別為=-1.566+0.529x和=-2.342+0.597x，它們的IC50半數(shù)抑制率分別是909μg/ml和8416μg/ml，結(jié)果顯示兩者的IC50相差較大，那么表明防御素的細胞增殖抑制作用比羥基脲高。
　　用流式細胞儀檢測抗菌肽防御素MD對人肝癌細胞HepG2細胞周期的影響結(jié)果：結(jié)果顯示GI期與M

11、期的細胞比例有所增加，而S期細胞比例反而下降。顯示結(jié)果中只有GI期和S期與PBS對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)，說明抗菌肽防御素MD使HepG2細胞周期在GI期停滯致使S期DNA的合成受到抑制。SW480，SIHA，HepG2這幾種腫瘤細胞之間的增殖抑制率在不同濃度組抗菌肽防御素MD作用下均無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)?？咕姆烙豈D對HepG2細胞caspase-3含量的影響結(jié)果：防御素組caspase-3的含量高于PBS

12、對照組，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論
　　通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)家蠅幼蟲抗菌肽防御素defensin基因具有其特定的結(jié)構(gòu)，可能具有抗菌活性及其他生物學(xué)活性；家蠅抗菌肽融合蛋白pGEX-6P-1/MD被成功克隆和表達，證明這三種腫瘤細胞SW480，SIHA，HepG2都能被純化蛋白MD抑制殺傷，這為以后研發(fā)家蠅抗菌肽防御素類藥物提供了依據(jù)。
　　抗菌肽防御素MD能夠抑制大腸桿菌生長繁殖活性；SW480，SIHA，H

13、epG2三種腫瘤細胞均能被抗菌肽MD所抑制，但正常人體心肌細胞H9C2不能被其抑制；抗菌肽防御素比羥基脲對HepG2細胞具有更好的增殖抑制作用；SW480，SIHA，HepG2腫瘤細胞的抑制作用與抗菌肽MD呈劑量效應(yīng)關(guān)系；將傳統(tǒng)抗腫瘤藥物與家蠅抗菌肽防御素MD比較，家蠅抗菌肽MD既能有效殺傷腫瘤細胞，又不損傷正常人體心肌細胞H9C2；家蠅抗菌肽MD可能通過兩種途徑發(fā)揮抑制腫瘤作用：肝癌細胞HepG2細胞周期受到抑制S期DNA的合成的影響