家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞K562作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：
　　 1．從三齡家蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)分離純化，篩選具有抗腫瘤細(xì)胞K562（人慢性髓性白血病細(xì)胞）的抗菌肽，并鑒定其是否對(duì)人正常細(xì)胞293T 有抑制作用。
　　 2.觀察分離純化得到的抗菌肽對(duì)K562細(xì)胞存活率及生長(zhǎng)曲線的影響，以及其對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響，判斷其活性發(fā)揮的最佳質(zhì)量濃度和作用時(shí)間，同時(shí)判斷抗菌肽對(duì)K562細(xì)胞膜的損傷程度，以及作用機(jī)制是否有直接殺傷作用；
　　 3．觀察分離純化得到的抗菌肽對(duì)K562細(xì)

2、胞細(xì)胞核和線粒體膜電位以及凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase-3）的影響，從而探討抗菌肽殺傷K562的作用機(jī)制是否有誘導(dǎo)凋亡。
　　 方法：
　　 1．通過(guò)針刺感染大腸桿菌誘導(dǎo)家蠅三齡幼蟲(chóng)大量表達(dá)抗菌肽，然后經(jīng)過(guò)研磨、離心、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）、反相高效液相色譜（reversed-phase high-performanceliquid chromatography,

3、RP-HPLC）分離純化家蠅三齡幼蟲(chóng)抗菌肽，采用四甲基偶氮噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）比色法和光學(xué)顯微鏡觀察，篩選出對(duì)K562 有殺傷作用的抗菌肽。通過(guò)對(duì)比反相高效液相色譜儀在紫外波長(zhǎng)214 nm和280nm時(shí)的色譜圖鑒定純化組分的蛋白質(zhì)性。同時(shí)用MTT 法檢測(cè)篩選出的抗菌肽組分峰5～8對(duì)人正常細(xì)胞293T的作用。
　　 2.采用臺(tái)盼藍(lán)拒染計(jì)數(shù)法，記錄不同作用濃度和不同作用時(shí)間時(shí)K

4、562細(xì)胞的存活率及其相對(duì)抑制率，從而繪制生長(zhǎng)曲線，觀察發(fā)揮活性的最佳質(zhì)量作用濃度和作用時(shí)間；同時(shí)用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；
　　 3.小分子熒光素二乙酸熒光素FDA（Fluorescein Diacetate）標(biāo)記，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞膜熒光素的滲漏；用大分子熒光探針Dextran-FITC(40KD)標(biāo)記，激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocAlmicroscope, LSCM）觀察對(duì)K

5、562細(xì)胞膜對(duì)大分子的通透性；
　　 4.用Hoechst33258 熒光標(biāo)記，用熒光顯微鏡檢測(cè)家蠅三齡幼蟲(chóng)峰5、峰8組分作用于K562細(xì)胞后，K562細(xì)胞核相對(duì)熒光強(qiáng)度的變化；以采用熒光探針羅丹明123 負(fù)載，用激光共聚焦顯微鏡觀察家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽對(duì)K562細(xì)胞線粒體膜電位的影響，以細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度表示線粒體膜電位大小。用caspase-3 檢測(cè)試劑盒和酶標(biāo)儀測(cè)定caspase-3 酶的活性。
　　 結(jié)果：
　　

6、1.固相萃取得到10％、30％、80％的的乙腈水溶液組分與對(duì)照組比較，經(jīng)方差分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中用Dunnett-t 法對(duì)各組分分別與對(duì)照組進(jìn)行比較，三個(gè)組分與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中sp8組分對(duì)K562細(xì)胞相對(duì)抑制率（inhibitionratio,IR）最高為84.98％。其中sp8組分經(jīng)反相高效液相色譜純化，通過(guò)觀察波長(zhǎng)為214 nm和280nm 條件下的色譜圖，并根據(jù)保留時(shí)間和分離度推斷

7、出：波長(zhǎng)214 nm時(shí)出現(xiàn)的峰5～8分別與波長(zhǎng)280nm時(shí)出現(xiàn)的峰c～f 相對(duì)應(yīng)，同時(shí)，因?yàn)?80nm是含芳香族氨基酸蛋白質(zhì)的特質(zhì)吸收峰，所以認(rèn)為峰5～8組分就是抗菌肽。根據(jù)分離度判定標(biāo)準(zhǔn)，4個(gè)峰組分的分離度都在1.5 以上，滿足定量分析的要求，所以選擇這4個(gè)峰進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)Dunnett-t 法檢驗(yàn)，峰5～8分別與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1-3），說(shuō)明這4個(gè)峰（峰5～8）對(duì)K562細(xì)胞都有抑制作用。當(dāng)質(zhì)量濃

8、度為100μg/ml作用24 h，峰5和峰8 相對(duì)抑制率較高，分別為48.52％和65.80％。Sp8和峰5～8組分分別與對(duì)照組比較，經(jīng)t 檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明抗菌肽sp8組分和峰5～8組分都對(duì)人正常細(xì)胞293T 無(wú)抑制作用。
　　 2.臺(tái)盼蘭拒染計(jì)數(shù)法檢測(cè)存活率和生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)：檢測(cè)到的不同質(zhì)量濃度的sp8和峰5～ 8 處理K562細(xì)胞24 h后，各組分對(duì)K562細(xì)胞都有抑制作用，但是不成線性關(guān)系，25μ

9、g/ml基本沒(méi)有作用，50μg/ml時(shí)對(duì)K562細(xì)胞的作用較低，100μg/ml在細(xì)胞的抑制基本由不到半數(shù)到超過(guò)半數(shù)，以sp8、峰5、峰8組最為明顯。低質(zhì)量濃度組(<25 μg/ml)與對(duì)照組（0μg/ml）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；高質(zhì)量濃度組分別與低質(zhì)量濃度組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)質(zhì)量濃度為50μg/ml和100μg/ml時(shí)，峰5、峰8分別和峰6、峰7組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0

10、5）。Sp8和峰5、峰8作用組質(zhì)量濃度為100μg/ml對(duì)K562細(xì)胞作用24小時(shí)后，在100倍光鏡下，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)完整；，對(duì)照組K562細(xì)胞視野凌亂，呈現(xiàn)出破碎程度不等的狀態(tài)，細(xì)胞發(fā)生變形，有的細(xì)胞形成缺口，內(nèi)容物正在通過(guò)缺口向外釋放，即將發(fā)生細(xì)胞分解。Sp8、峰5～8 各組分當(dāng)濃度為50μg/ml和100μg/ml時(shí)，隨著作用時(shí)間的增加， K562細(xì)胞的抑制率基本上呈逐漸升高，到24 h 左右達(dá)到一個(gè)高峰后開(kāi)始逐漸降低，當(dāng)在48

11、h時(shí)進(jìn)行換液加藥后，抑制率再次呈逐漸升高繼而下降的趨勢(shì)；當(dāng)濃度為200μg/ml時(shí)，隨著作用時(shí)間的增加, K562細(xì)胞的抑制率表現(xiàn)為持續(xù)上升，當(dāng)48 h時(shí)進(jìn)行換液處理后，抑制率明顯升高繼而持續(xù)上升。另外，對(duì)K562細(xì)胞的抑制率在48 h時(shí)處理前后均不成線性關(guān)系。
　　 3.不同濃度峰5和峰8處理K562細(xì)胞后，作用濃度低于50μg/ml的低濃度組相對(duì)熒光強(qiáng)度為（18.95±0.05）～（22.49±0.68），作用濃度50μg/

12、ml以上的高濃度組相對(duì)熒光強(qiáng)度為（62.77±4.08）～（70.81±0.18）。經(jīng)單因素方差分析，高濃度各組（>50μg/ml）相對(duì)熒光強(qiáng)度分別與低濃度各組(<50μg/ml)進(jìn)行兩兩比較LSD法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。峰5、峰8作用2 h后，K562細(xì)胞膜對(duì)小分子熒光素FDA均有外泄。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察到，細(xì)胞經(jīng)100μg/mL的l峰5、峰8組分處理2 h，40KD的大分子熒光探針Dextran-FITC,個(gè)別

13、分布在細(xì)胞膜上，而經(jīng)24小時(shí)處理后，熒光探針進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)形成亮點(diǎn)或亮塊，強(qiáng)度不一。這說(shuō)明表明處理達(dá)到一定時(shí)間，細(xì)胞膜能通過(guò)40KD的大分子。4. Hoechst33258染色顯示：對(duì)照組的細(xì)胞核接近圓形，染色均勻而明亮，而 當(dāng)質(zhì)量濃度為100μg/ml的峰5和（或）峰8組分作用24 h后，有些細(xì)胞核破碎成塊狀,部分染色 呈彌散趨勢(shì),說(shuō)明家蠅三齡幼蟲(chóng)抗菌肽可以引起K562細(xì)胞核損傷；部分細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明可以引起K562細(xì)胞

14、發(fā)生凋亡；用羅丹明123標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與抗菌肽峰5、峰8組的熒光強(qiáng)度經(jīng)t檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)羅丹明123熒光強(qiáng)度很強(qiáng)，而抗菌肽組峰5、峰8作用組細(xì)胞內(nèi)羅丹明123熒光強(qiáng)度很弱，說(shuō)明家蠅三齡幼蟲(chóng)抗菌肽可以使K562細(xì)胞線粒體膜電位降低；抗菌肽峰5、峰8組分作用組caspase-3的含量明顯高于對(duì)照組，兩組caspase-3含量經(jīng)t 檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明家蠅三齡幼蟲(chóng)抗菌

15、肽作用K562細(xì)胞后可以激活caspase-3，促進(jìn)凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 1.家蠅三齡幼蟲(chóng)體內(nèi)存在抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)的抗菌肽和抗菌物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)得到峰5～8抗菌肽，其中峰5和峰8對(duì)K562細(xì)胞的抑制活性最強(qiáng)，對(duì)人正常細(xì)胞293T幾乎沒(méi)有作用，這與多數(shù)文獻(xiàn)的報(bào)道一致。
　　 2.家蠅三齡幼蟲(chóng)抗菌肽對(duì)K562細(xì)胞膜的作用存在質(zhì)量濃度閾值，低質(zhì)量濃度時(shí)可引起膜通透性增加，高質(zhì)量濃度時(shí)可引起細(xì)胞膜嚴(yán)重?fù)p傷。家蠅幼蟲(chóng)