ERp57在人卵巢癌細(xì)胞紫杉醇耐藥中的作用.pdf

1、目的:
　　 卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤,死亡率居?jì)D科腫瘤之首?；熓悄壳爸委熉殉舶┑闹匾侄沃?。常用的化療方案為紫杉醇聯(lián)合順鉑。紫杉醇的化療耐藥也是影響晚期卵巢癌患者預(yù)后的主要原因之一。卵巢癌耐藥的發(fā)生及逆轉(zhuǎn)機(jī)制已成為當(dāng)前婦產(chǎn)科學(xué)界極其緊迫而重要的研究課題。
　　 目前研究相對(duì)清楚的紫杉醇耐藥機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面:1、某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因過度表達(dá)以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。2、β微管蛋白的基因以及蛋白表達(dá)的改變。3、

2、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白或細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的基因表達(dá)異常,如抗凋亡蛋白表達(dá)上調(diào),促調(diào)亡蛋白表達(dá)下調(diào)等。4、紫杉醇耐藥相關(guān)基因過表達(dá)等。盡管目前對(duì)耐藥機(jī)制研究已經(jīng)相對(duì)深入,但是對(duì)臨床的指導(dǎo)意義和應(yīng)用價(jià)值卻很有限。故有必要探索新的耐藥相關(guān)分子,為進(jìn)一步研究紫杉醇耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 目前通過基因芯片表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn),在化療耐受的卵巢癌組織和細(xì)胞中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)固有蛋白ERp57(又名GRp58,PDIA3)的表達(dá)變化,ERp57的表達(dá)與化療耐

3、受相關(guān)。ERp57蛋白屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶,為蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(PDI)成員之一,是由兩個(gè)無催化作用的結(jié)構(gòu)域組成的蛋白質(zhì)。ERp57主要以分子伴侶的形式定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,參與蛋白質(zhì)的正確折疊和糖蛋白的質(zhì)量控制,此外,ERp57在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中也有表達(dá)。定位于細(xì)胞質(zhì)中的ERp57與Stat3激活的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)密切相關(guān);而定位于細(xì)胞核中的ERp57則在細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性響應(yīng)中起到重要作用,尤其是核苷酸類似物對(duì)DNA損

4、傷作用的響應(yīng)。ERp57作為一種應(yīng)激蛋白,在低糖、低氧、低Ca2+等應(yīng)激狀態(tài)下大量表達(dá)以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定,保護(hù)細(xì)胞。
　　 近年來的研究發(fā)現(xiàn)二硫鍵異構(gòu)酶表達(dá)不僅僅與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān),也同樣參與了腫瘤的耐藥性獲得過程。ERp57在卵巢癌、B細(xì)胞淋巴瘤、急性髓細(xì)胞白血病、乳腺癌、宮頸癌細(xì)胞的化療耐藥形成起到了重要作用。LuciaCicchillitt等通過蛋白質(zhì)二維電泳分析了卵巢癌耐藥細(xì)胞株及敏感細(xì)胞株中的差異蛋白,ERp57是1

5、01個(gè)差異蛋白中差異最明顯的一個(gè)。ERp57與β-Ⅲtubulin和β-actin等細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白形成復(fù)合物,在耐藥細(xì)胞起到了對(duì)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的折疊和氧化還原作用,調(diào)節(jié)了微管與染色體的結(jié)合,也對(duì)紡錘體的動(dòng)力學(xué)組裝中發(fā)揮作用。
　　 為明確ERp57與紫杉醇耐受的關(guān)系并進(jìn)一步探索ERp57在卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的獲得性耐受過程中的作用,我們利用獲購的穩(wěn)定耐受紫杉醇的卵巢癌細(xì)胞株(耐藥細(xì)胞株中ERp57蛋白表達(dá)上調(diào)),應(yīng)用免疫印跡

6、方法觀察紫杉醇作用后的耐藥卵巢癌細(xì)胞與其親本細(xì)胞內(nèi)ERp57蛋白的表達(dá)改變,并通過SiRNA干擾技術(shù)下調(diào)ERp57,以改變ERp57表達(dá)水平,觀察ERp57表達(dá)水平改變后原細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性的改變,旨在為臨床預(yù)示卵巢癌的治療反應(yīng)和治療卵巢癌提供新靶點(diǎn)。并通過體外試驗(yàn)進(jìn)一步探討其在卵巢癌耐藥中的機(jī)制,以期為卵巢癌耐藥臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 研究內(nèi)容及方法:
　　 1、用MTT法測(cè)定細(xì)胞生存率,計(jì)算卵巢癌耐藥

7、細(xì)胞株skov3/tax和oc3/tax細(xì)胞的耐藥性,并比較敏感細(xì)胞skov3和oc3與對(duì)應(yīng)耐藥細(xì)胞skov3/tax和oc3/tax細(xì)胞形態(tài)、生長曲線及群體倍增時(shí)間的差異。
　　 2、采用Westernblot方法檢測(cè)敏感細(xì)胞skov3和oc3與對(duì)應(yīng)耐藥細(xì)胞skov3/tax和oc3/tax的ERp57表達(dá)水平及誘導(dǎo)中表達(dá)變化趨勢(shì)。
　　 3、卵巢癌紫杉醇耐藥相關(guān)候選因子ERp57的功能研究。利用化學(xué)合成的ERp57基

8、因特異性SiRNA,轉(zhuǎn)染紫杉醇耐藥細(xì)胞株,利用Westernblot和RealtimePCR檢測(cè)ERp57的表達(dá)情況。MTT法檢測(cè)耐藥性的變化。利用RealtimePCR檢測(cè)MDR-1和MRP-1的表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-gp底物羅丹明123熒光強(qiáng)度變化。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、MTT法測(cè)定的結(jié)果顯示,紫杉醇耐藥細(xì)胞株skov3/tax和oc3/tax的耐藥指數(shù)分別為4.01±0.62和4.11±0.22。細(xì)胞形態(tài)

9、比較顯示耐藥細(xì)胞skov3/tax和oc3/tax的多形核、畸形核細(xì)胞較其對(duì)應(yīng)的敏感細(xì)胞常見。細(xì)胞生長周期的結(jié)果提示耐藥細(xì)胞周期中G0-G1期比率增加,S期比率減少,差異顯著,M期細(xì)胞比率變化不大。耐藥細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為36h,較敏感細(xì)胞增加了1.52倍。
　　 2、Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明耐藥細(xì)胞株skov3/tax和oc3/tax的ERp57表達(dá)水平均較敏感細(xì)胞上調(diào)。以紫杉醇IC50濃度處理skov3細(xì)胞,在5分

10、～120分的不同時(shí)間點(diǎn),檢測(cè)ERp57表達(dá)水平有輕度增加。Skov3細(xì)胞在%倍～4倍濃度紫杉醇作用24小時(shí)后,隨紫杉醇濃度增加,ERp57表達(dá)量逐漸增加。Skov3/tax細(xì)胞在1/8倍～2倍IC50紫杉醇濃度作用下,ERp57表達(dá)低于本底的表達(dá)水平,當(dāng)濃度繼續(xù)增加至2倍和4倍IC50紫杉醇濃度,ERp57恢復(fù)本底水平。
　　 3、ERp57-SiRNA降低ERp57表達(dá)水平后,利用Westernblot和RealtimePCR

11、驗(yàn)證了干擾成功。降低ERp57表達(dá)水平能夠提高耐藥細(xì)胞的紫杉醇敏感性。RealtimePCR檢測(cè)到了,降低ERp57表達(dá)水平同時(shí)MDR-1和MRP-1的表達(dá)降低。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,降低ERp57表達(dá)水平能提高耐藥細(xì)胞中P-gp底物羅丹明123的平均熒光強(qiáng)度,即抑制了P-gp介導(dǎo)的羅丹明123的外排。
　　 研究結(jié)論:
　　 1、耐藥細(xì)胞skov3/tax和oc3/tax與敏感細(xì)胞的生物學(xué)形態(tài)有明顯差異,MTT測(cè)定的耐藥