ERp57在人卵巢癌細胞紫杉醇耐藥中的作用.pdf

1、目的:
　　 卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤,死亡率居婦科腫瘤之首?；熓悄壳爸委熉殉舶┑闹匾侄沃?。常用的化療方案為紫杉醇聯(lián)合順鉑。紫杉醇的化療耐藥也是影響晚期卵巢癌患者預后的主要原因之一。卵巢癌耐藥的發(fā)生及逆轉機制已成為當前婦產科學界極其緊迫而重要的研究課題。
　　 目前研究相對清楚的紫杉醇耐藥機制主要包括以下幾個方面:1、某些轉運蛋白基因過度表達以及細胞信號轉導通路的激活。2、β微管蛋白的基因以及蛋白表達的改變。3、

2、細胞凋亡相關蛋白或細胞周期調控蛋白的基因表達異常,如抗凋亡蛋白表達上調,促調亡蛋白表達下調等。4、紫杉醇耐藥相關基因過表達等。盡管目前對耐藥機制研究已經(jīng)相對深入,但是對臨床的指導意義和應用價值卻很有限。故有必要探索新的耐藥相關分子,為進一步研究紫杉醇耐藥機制奠定基礎。
　　 目前通過基因芯片表達譜研究發(fā)現(xiàn),在化療耐受的卵巢癌組織和細胞中存在內質網(wǎng)固有蛋白ERp57(又名GRp58,PDIA3)的表達變化,ERp57的表達與化療耐

3、受相關。ERp57蛋白屬于內質網(wǎng)上的分子伴侶,為蛋白質二硫化物異構酶(PDI)成員之一,是由兩個無催化作用的結構域組成的蛋白質。ERp57主要以分子伴侶的形式定位于內質網(wǎng)上,參與蛋白質的正確折疊和糖蛋白的質量控制,此外,ERp57在細胞質和細胞核中也有表達。定位于細胞質中的ERp57與Stat3激活的細胞信號轉導和轉錄調節(jié)密切相關;而定位于細胞核中的ERp57則在細胞對抗腫瘤藥物的細胞毒性響應中起到重要作用,尤其是核苷酸類似物對DNA損

4、傷作用的響應。ERp57作為一種應激蛋白,在低糖、低氧、低Ca2+等應激狀態(tài)下大量表達以維持內質網(wǎng)的穩(wěn)定,保護細胞。
　　 近年來的研究發(fā)現(xiàn)二硫鍵異構酶表達不僅僅與腫瘤的侵襲轉移有關,也同樣參與了腫瘤的耐藥性獲得過程。ERp57在卵巢癌、B細胞淋巴瘤、急性髓細胞白血病、乳腺癌、宮頸癌細胞的化療耐藥形成起到了重要作用。LuciaCicchillitt等通過蛋白質二維電泳分析了卵巢癌耐藥細胞株及敏感細胞株中的差異蛋白,ERp57是1

5、01個差異蛋白中差異最明顯的一個。ERp57與β-Ⅲtubulin和β-actin等細胞骨架相關蛋白形成復合物,在耐藥細胞起到了對細胞骨架相關蛋白的折疊和氧化還原作用,調節(jié)了微管與染色體的結合,也對紡錘體的動力學組裝中發(fā)揮作用。
　　 為明確ERp57與紫杉醇耐受的關系并進一步探索ERp57在卵巢癌細胞對紫杉醇的獲得性耐受過程中的作用,我們利用獲購的穩(wěn)定耐受紫杉醇的卵巢癌細胞株(耐藥細胞株中ERp57蛋白表達上調),應用免疫印跡

6、方法觀察紫杉醇作用后的耐藥卵巢癌細胞與其親本細胞內ERp57蛋白的表達改變,并通過SiRNA干擾技術下調ERp57,以改變ERp57表達水平,觀察ERp57表達水平改變后原細胞對紫杉醇敏感性的改變,旨在為臨床預示卵巢癌的治療反應和治療卵巢癌提供新靶點。并通過體外試驗進一步探討其在卵巢癌耐藥中的機制,以期為卵巢癌耐藥臨床治療提供理論依據(jù)和實驗基礎。
　　 研究內容及方法:
　　 1、用MTT法測定細胞生存率,計算卵巢癌耐藥

7、細胞株skov3/tax和oc3/tax細胞的耐藥性,并比較敏感細胞skov3和oc3與對應耐藥細胞skov3/tax和oc3/tax細胞形態(tài)、生長曲線及群體倍增時間的差異。
　　 2、采用Westernblot方法檢測敏感細胞skov3和oc3與對應耐藥細胞skov3/tax和oc3/tax的ERp57表達水平及誘導中表達變化趨勢。
　　 3、卵巢癌紫杉醇耐藥相關候選因子ERp57的功能研究。利用化學合成的ERp57基

8、因特異性SiRNA,轉染紫杉醇耐藥細胞株,利用Westernblot和RealtimePCR檢測ERp57的表達情況。MTT法檢測耐藥性的變化。利用RealtimePCR檢測MDR-1和MRP-1的表達。流式細胞儀檢測P-gp底物羅丹明123熒光強度變化。
　　 研究結果:
　　 1、MTT法測定的結果顯示,紫杉醇耐藥細胞株skov3/tax和oc3/tax的耐藥指數(shù)分別為4.01±0.62和4.11±0.22。細胞形態(tài)

9、比較顯示耐藥細胞skov3/tax和oc3/tax的多形核、畸形核細胞較其對應的敏感細胞常見。細胞生長周期的結果提示耐藥細胞周期中G0-G1期比率增加,S期比率減少,差異顯著,M期細胞比率變化不大。耐藥細胞的群體倍增時間為36h,較敏感細胞增加了1.52倍。
　　 2、Westernblot檢測結果表明耐藥細胞株skov3/tax和oc3/tax的ERp57表達水平均較敏感細胞上調。以紫杉醇IC50濃度處理skov3細胞,在5分

10、～120分的不同時間點,檢測ERp57表達水平有輕度增加。Skov3細胞在%倍～4倍濃度紫杉醇作用24小時后,隨紫杉醇濃度增加,ERp57表達量逐漸增加。Skov3/tax細胞在1/8倍～2倍IC50紫杉醇濃度作用下,ERp57表達低于本底的表達水平,當濃度繼續(xù)增加至2倍和4倍IC50紫杉醇濃度,ERp57恢復本底水平。
　　 3、ERp57-SiRNA降低ERp57表達水平后,利用Westernblot和RealtimePCR

11、驗證了干擾成功。降低ERp57表達水平能夠提高耐藥細胞的紫杉醇敏感性。RealtimePCR檢測到了,降低ERp57表達水平同時MDR-1和MRP-1的表達降低。流式細胞儀結果顯示,降低ERp57表達水平能提高耐藥細胞中P-gp底物羅丹明123的平均熒光強度,即抑制了P-gp介導的羅丹明123的外排。
　　 研究結論:
　　 1、耐藥細胞skov3/tax和oc3/tax與敏感細胞的生物學形態(tài)有明顯差異,MTT測定的耐藥