rMBP-NAP在黑色素瘤B16-F10肺轉(zhuǎn)移模型上的抗腫瘤作用及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　近些年來(lái)黑色素瘤發(fā)生率不斷升高，傳統(tǒng)的治療方法不能取得理想的治療效果，采用免疫治療聯(lián)合傳統(tǒng)治療手段如化療，激活機(jī)體免疫應(yīng)答是有效治療黑色素瘤的方法。腫瘤局部微環(huán)境為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供了庇護(hù)場(chǎng)所，通過(guò)誘導(dǎo)血管生成，形成免疫耐受等有利于腫瘤的惡化和轉(zhuǎn)移。靶向腫瘤微環(huán)境是有效治療腫瘤的方法，通過(guò)作用與腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制有利于機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用，通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)血管生成有利于控制腫瘤惡化和轉(zhuǎn)移等。為了進(jìn)一步探討免

2、疫調(diào)節(jié)劑rMBP-NAP的抗腫瘤作用，研究rMBP-NAP對(duì)腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生影響，我們利用高轉(zhuǎn)移的 B16-F10黑色色素瘤建立小鼠肺轉(zhuǎn)移模型，研究rMBP-NAP對(duì)腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生的影響以及其生物學(xué)意義。
　　方法:
　　1.選擇鼠源的高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞 B16-F10細(xì)胞株，通過(guò)尾部皮下靜脈注射腫瘤細(xì)胞的方法，建立小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型。
　　2.選擇不同給藥劑量：低劑量組10μg/只、中劑量組50μg/只、高劑量組

3、100μg/只，每48小時(shí)給藥一次，連續(xù)給藥7次。根據(jù)不同給藥劑量對(duì)腫瘤肺轉(zhuǎn)移的影響，篩選最適給藥劑量，研究討論 rMBP-NAP對(duì)小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的抑制作用。
　　3.采用 ELISPOT方法檢測(cè)腫瘤模型中，rMBP-NAP給藥后分泌 IFN-γ的脾臟細(xì)胞數(shù)量的變化；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法檢測(cè)脾臟中 Th1、Th2型細(xì)胞因子表達(dá)情況；采用細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)研究 rMBP-NAP給藥后效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷情況。
　　4

4、.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)肺組織中 Th1型細(xì)胞因子的變化情況以及腫瘤微環(huán)境中維持腫瘤內(nèi)部穩(wěn)態(tài)相關(guān)的炎性細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)情況；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)浸潤(rùn)到腫瘤微環(huán)境中 CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)量的變化；對(duì)腫瘤組織中 CD34+血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫組化染色，檢測(cè)腫瘤組織中血管生成并檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)變化。
　　5.通過(guò)體外培養(yǎng)黑色素瘤細(xì)胞 B16-F10，檢測(cè) rMBP-NAP與腫瘤細(xì)

5、胞共同孵育后對(duì)腫瘤細(xì)胞粘附和遷移的影響。
　　結(jié)果:
　　1. C57BL/6小鼠尾部皮下靜脈注射黑色素瘤細(xì)胞B16-F10形成腫瘤肺轉(zhuǎn)移成功率100％，成功建立黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型。
　　2. rMBP-NAP抑制了黑色素瘤細(xì)胞B16-F10肺轉(zhuǎn)移灶形成數(shù)量，選擇50μg/只作為rMBP-NAP抗腫瘤藥效劑量。
　　3. ELISPOT檢測(cè)結(jié)果顯示，rMBP-NAP作用后分泌IFN-γ脾細(xì)胞數(shù)量顯著增多；脾臟中T

6、h1型細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ、IL-27表達(dá)顯著上升，Th2型細(xì)胞因子 IL-4表達(dá)顯著下降；外周血單個(gè)核細(xì)胞和脾臟細(xì)胞對(duì)黑色素瘤細(xì)胞 B16-F10的殺傷作用增強(qiáng)。
　　4. rMBP-NAP作用后肺組織Th1型細(xì)胞因子表達(dá)顯著上升；炎性因子如IL-6、TNF-α和趨化因子如 CCL2、CCL20表達(dá)水平顯著下降；浸潤(rùn)到腫瘤微環(huán)境中的 CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著升高；肺組織中 VEGF表達(dá)量顯

7、著下降,腫瘤血管生成受到抑制。
　　5.體外 rMBP-NAP與黑色素瘤細(xì)胞 B16-F10共同孵育，對(duì)腫瘤細(xì)胞的粘附和遷移沒(méi)有明顯影響。
　　結(jié)論:
　　1. rMBP-NAP顯著減少黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量。
　　2. rMBP-NAP引起Th1反應(yīng)，激活系統(tǒng)性的抗腫瘤免疫應(yīng)答。
　　3. rMBP-NAP顯著增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中Th1細(xì)胞因子表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的炎癥微環(huán)境和免疫抑制微環(huán)境