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文檔簡介
1、結(jié)核病是一個全球范圍的健康難題,全世界有三分之一的人感染結(jié)核病,并且每年以上百萬的人數(shù)在增加。結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病的一類病原菌,它能侵犯人體的各個器官,但以肺部結(jié)核病最嚴重。盡管預防疫苗以及用于治療結(jié)核病的抗結(jié)核菌藥物不斷出現(xiàn),但是由于耐藥性菌株的不斷出現(xiàn),以及結(jié)核病與HIV共感染,結(jié)核病目前仍然是威脅人類健康的主要傳染病。
結(jié)核分枝桿菌在感染人體以及在巨噬細胞中成功的生存下來的過程中會面臨來自機體的多種壓力條件,其中包括
2、由巨噬細胞產(chǎn)生的氧化壓力,吞噬體產(chǎn)生的酸性壓力,肺泡表面活性物質(zhì)引起的表面結(jié)構(gòu)的損傷,以及在肉芽腫以及吞噬體中的低氧環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏。除此之外,分枝桿菌在傳播過程中還會遭受到紫外的照射,脫水,以及低溫等多種壓力。結(jié)核分枝桿菌能夠在這些環(huán)境中生存并適應(yīng)下來,需要復雜的基因的調(diào)控。
結(jié)核分枝桿菌PPE家族基因因其在結(jié)核分枝桿菌與宿主間的相互作用中發(fā)揮重要的功能而越來越被重視。該家族基因主要參與結(jié)核分枝桿菌的毒力,作為抗原變異的
3、來源,以及作為血清診療工具等發(fā)揮作用。通過文獻調(diào)研,我們發(fā)現(xiàn)PPE家族的一個基因—PPE19,是結(jié)核分枝桿菌壓力反應(yīng)因子SigB的一個重要的調(diào)控子。SigB基因在細菌壓力反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用,sigB缺失菌株對類似SDS誘導的表面壓力、氧化壓力、熱激以及萬古霉素等均表現(xiàn)得更加敏感。我們推測PPE19作為SigB因子的一個調(diào)控子,可能也會在應(yīng)對這些或其中某種壓力環(huán)境中發(fā)揮一定的作用。
為了研究PPE19是否會在結(jié)核分枝桿菌應(yīng)對
4、環(huán)境壓力中發(fā)揮作用,我們首先以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組為模板,對PPE19(Rv1361c)基因進行了克隆,并將其與帶有Myc標簽的穿梭質(zhì)粒pNIT連接,獲得pNIT-Rv1361c重組質(zhì)粒,之后重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入生長速度較快且無毒力的恥垢分枝桿菌mc2155菌株中,成功構(gòu)建了表達PPE19重組蛋白的重組恥垢分枝桿菌。通過分級分離以及蛋白酶K消化分析,應(yīng)用Western-blotting技術(shù)檢測了目的蛋白在重組恥垢分枝桿菌中的定位。為了研
5、究外源PPE19蛋白的過表達是否會對恥垢分枝桿菌的生長產(chǎn)生影響,我們檢測了PPE19重組菌與只含有pNIT空載的恥垢分枝桿菌對照菌的生長曲線。為了解PPE19蛋白是否與結(jié)核分枝桿菌在多種壓力環(huán)境下的存活相關(guān),我們檢測了PPE19重組菌以及空載菌在營養(yǎng)饑餓條件下,酸性條件,SDS引起的表面壓力,由聯(lián)氨誘導的氧化壓力,以及抗生素(異煙肼,諾氟沙星),酸性NO等體外壓力環(huán)境下的生長情況,同時檢測了PPE19的過表達菌株在巨噬細胞內(nèi)的存活以及對
6、巨噬細胞的影響。
我們的研究結(jié)果表明,PPE19(Rv1361c or mtb39b)只存在于結(jié)核分枝桿菌的牛分枝桿菌中。盡管PPE19定位在細胞表面,但是并沒有對恥垢分枝桿菌的表面特性如菌落形態(tài),生物膜的形成等產(chǎn)生明顯的影響。然而,PPE19的過表達增強了恥垢分枝桿菌在穩(wěn)定期的生長,增加了對饑餓條件,酸性壓力,表面壓力,氧化壓力以及異煙肼藥物等多種壓力環(huán)境的耐受。值得注意的是,盡管PPE19對多種壓力條件產(chǎn)生耐受性,然而對于
7、諾氟沙星和酸性NaNO2的處理卻表現(xiàn)出一定的敏感性。盡管PPE19在應(yīng)對體外多種壓力環(huán)境時表現(xiàn)出截然相反的結(jié)果,然而在具有多重壓力環(huán)境的RAW264.7巨噬細胞中,PPE19明顯增強恥垢分枝桿菌的存活,但是沒有明顯改變細胞內(nèi)相關(guān)細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。
通過本研究,證實了結(jié)核分枝桿菌PPE19蛋白在應(yīng)對壓力脅迫中發(fā)揮了重要作用,可能是通過改變細胞表面組分或參與維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性完成的。本研究將為PPE家族基因添加新功能,同時為進一
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