結(jié)核分枝桿菌表面蛋白PPE19在壓力反應(yīng)和毒力中的作用研究.pdf

1、結(jié)核病是一個(gè)全球范圍的健康難題，全世界有三分之一的人感染結(jié)核病，并且每年以上百萬(wàn)的人數(shù)在增加。結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病的一類病原菌，它能侵犯人體的各個(gè)器官，但以肺部結(jié)核病最嚴(yán)重。盡管預(yù)防疫苗以及用于治療結(jié)核病的抗結(jié)核菌藥物不斷出現(xiàn)，但是由于耐藥性菌株的不斷出現(xiàn)，以及結(jié)核病與HIV共感染，結(jié)核病目前仍然是威脅人類健康的主要傳染病。
　　結(jié)核分枝桿菌在感染人體以及在巨噬細(xì)胞中成功的生存下來(lái)的過(guò)程中會(huì)面臨來(lái)自機(jī)體的多種壓力條件，其中包括

2、由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的氧化壓力，吞噬體產(chǎn)生的酸性壓力，肺泡表面活性物質(zhì)引起的表面結(jié)構(gòu)的損傷，以及在肉芽腫以及吞噬體中的低氧環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏。除此之外，分枝桿菌在傳播過(guò)程中還會(huì)遭受到紫外的照射，脫水，以及低溫等多種壓力。結(jié)核分枝桿菌能夠在這些環(huán)境中生存并適應(yīng)下來(lái)，需要復(fù)雜的基因的調(diào)控。
　　結(jié)核分枝桿菌PPE家族基因因其在結(jié)核分枝桿菌與宿主間的相互作用中發(fā)揮重要的功能而越來(lái)越被重視。該家族基因主要參與結(jié)核分枝桿菌的毒力，作為抗原變異的

3、來(lái)源，以及作為血清診療工具等發(fā)揮作用。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)PPE家族的一個(gè)基因—PPE19，是結(jié)核分枝桿菌壓力反應(yīng)因子SigB的一個(gè)重要的調(diào)控子。SigB基因在細(xì)菌壓力反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用，sigB缺失菌株對(duì)類似SDS誘導(dǎo)的表面壓力、氧化壓力、熱激以及萬(wàn)古霉素等均表現(xiàn)得更加敏感。我們推測(cè)PPE19作為SigB因子的一個(gè)調(diào)控子，可能也會(huì)在應(yīng)對(duì)這些或其中某種壓力環(huán)境中發(fā)揮一定的作用。
　　為了研究PPE19是否會(huì)在結(jié)核分枝桿菌應(yīng)對(duì)

4、環(huán)境壓力中發(fā)揮作用，我們首先以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組為模板，對(duì)PPE19（Rv1361c）基因進(jìn)行了克隆，并將其與帶有Myc標(biāo)簽的穿梭質(zhì)粒pNIT連接，獲得pNIT-Rv1361c重組質(zhì)粒，之后重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)速度較快且無(wú)毒力的恥垢分枝桿菌mc2155菌株中，成功構(gòu)建了表達(dá)PPE19重組蛋白的重組恥垢分枝桿菌。通過(guò)分級(jí)分離以及蛋白酶K消化分析，應(yīng)用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)了目的蛋白在重組恥垢分枝桿菌中的定位。為了研

5、究外源PPE19蛋白的過(guò)表達(dá)是否會(huì)對(duì)恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，我們檢測(cè)了PPE19重組菌與只含有pNIT空載的恥垢分枝桿菌對(duì)照菌的生長(zhǎng)曲線。為了解PPE19蛋白是否與結(jié)核分枝桿菌在多種壓力環(huán)境下的存活相關(guān)，我們檢測(cè)了PPE19重組菌以及空載菌在營(yíng)養(yǎng)饑餓條件下，酸性條件，SDS引起的表面壓力，由聯(lián)氨誘導(dǎo)的氧化壓力，以及抗生素（異煙肼，諾氟沙星），酸性NO等體外壓力環(huán)境下的生長(zhǎng)情況，同時(shí)檢測(cè)了PPE19的過(guò)表達(dá)菌株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活以及對(duì)

6、巨噬細(xì)胞的影響。
　　我們的研究結(jié)果表明，PPE19（Rv1361c or mtb39b）只存在于結(jié)核分枝桿菌的牛分枝桿菌中。盡管PPE19定位在細(xì)胞表面，但是并沒(méi)有對(duì)恥垢分枝桿菌的表面特性如菌落形態(tài)，生物膜的形成等產(chǎn)生明顯的影響。然而，PPE19的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了恥垢分枝桿菌在穩(wěn)定期的生長(zhǎng)，增加了對(duì)饑餓條件，酸性壓力，表面壓力，氧化壓力以及異煙肼藥物等多種壓力環(huán)境的耐受。值得注意的是，盡管PPE19對(duì)多種壓力條件產(chǎn)生耐受性，然而對(duì)于

7、諾氟沙星和酸性NaNO2的處理卻表現(xiàn)出一定的敏感性。盡管PPE19在應(yīng)對(duì)體外多種壓力環(huán)境時(shí)表現(xiàn)出截然相反的結(jié)果，然而在具有多重壓力環(huán)境的RAW264.7巨噬細(xì)胞中，PPE19明顯增強(qiáng)恥垢分枝桿菌的存活，但是沒(méi)有明顯改變細(xì)胞內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。
　　通過(guò)本研究，證實(shí)了結(jié)核分枝桿菌PPE19蛋白在應(yīng)對(duì)壓力脅迫中發(fā)揮了重要作用，可能是通過(guò)改變細(xì)胞表面組分或參與維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性完成的。本研究將為PPE家族基因添加新功能，同時(shí)為進(jìn)一