基于負(fù)載USPIO脂質(zhì)納米粒肝組織雙靶向分子影像實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipid nanoparticles，SLN)是近年來(lái)正在發(fā)展的一種新型納米粒給藥系統(tǒng)，以固態(tài)的天然或合成的類脂如單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、三酰甘油等為載體，將藥物或造影劑包裹于類脂核中制成酸態(tài)給藥體。因其表面的強(qiáng)疏水性，靜脈注射進(jìn)入機(jī)體后，很快被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(Reticuloendothelial system，RES)吞噬而被動(dòng)進(jìn)入肝脾，具有顯著的被動(dòng)肝靶向作用。去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglyco

2、protein receptor, ASGPR)是一種完全由哺乳動(dòng)物肝竇狀隙的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)的膜表面蛋白，能夠特異性地識(shí)別帶有半乳糖殘基的糖蛋白，每個(gè)肝細(xì)胞表面有多達(dá)5105個(gè)受體，而在肝炎、肝硬化、肝癌或肝轉(zhuǎn)移癌等肝臟疾病時(shí)，其數(shù)量和功能均有所下降。半乳糖是肝細(xì)胞表面ASGPR的特異性配體，是肝靶向基團(tuán)，具有誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支架材料上的粘附性能。本研究選擇以SLN作為載體，利用SLN自身的肝臟被動(dòng)靶向特征，結(jié)合肝臟的

3、主動(dòng)靶向修飾技術(shù)，制備了經(jīng)半乳糖修飾的以SLN為包被材料的對(duì)肝具有雙靶向功能的脂質(zhì)磁性納米粒Gal-SLN-USPIO，并在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中考察了其對(duì)正常肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及正常肝組織的靶向作用，以及對(duì)原位移植肝癌模型的診斷價(jià)值。具體研究?jī)?nèi)容主要包括以下四個(gè)部分:
　　第一部分:脂質(zhì)磁性納米粒的制備及理化性質(zhì)研究
　　本研究首先采用乳糖酸(LA)和硬脂胺(ODA)之間的化學(xué)耦合反應(yīng)制備半乳糖-硬脂胺嫁接物(Gal-ODA)，采

4、用核磁共振氫譜(1H NMR)和傅里葉變換紅外光譜(FTIR)對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證;在此基礎(chǔ)上，以單甘脂為脂質(zhì)材料，采用水性溶劑擴(kuò)散法分別制備對(duì)肝臟具有被動(dòng)靶向功能的脂質(zhì)磁性納米粒(SLN-USPIO)、主動(dòng)靶向功能的脂質(zhì)磁性納米粒(Gal-SLN-USPIO/PEG)及雙重靶向功能的脂質(zhì)磁性納米粒(Gal-SLN-USPIO)，其中SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG作為對(duì)照組，并對(duì)三種脂質(zhì)磁性納米粒的理化性質(zhì)進(jìn)行了

5、評(píng)價(jià)。采用微粒粒度及表面電位分析儀測(cè)定三種不同的脂質(zhì)磁性納米粒的粒徑、表面電位及其分布，采用透射電鏡(TEM)觀察脂質(zhì)磁性納米粒的形態(tài)。研究結(jié)果表明，本研究所制備得到的三種脂質(zhì)磁性納米粒數(shù)均粒徑在45～60 nm之間，表面電位在-27～-35 mV之間，多分散指數(shù)在0.14～0.35之間，三者之間無(wú)顯著性差異;脂質(zhì)磁性納米粒均呈擬球形，大小均勻，表面平滑完整，顆粒分散性良好，常溫放置2周后未見(jiàn)明顯聚集現(xiàn)象;外加強(qiáng)磁場(chǎng)吸附實(shí)驗(yàn)考察證實(shí)脂質(zhì)

6、納米粒中均包裹有磁性Fe3O4納米顆粒。
　　第二部分:脂質(zhì)磁性納米粒的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及在體正常肝組織靶向性研究
　　本研究采用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記脂質(zhì)磁性納米粒;以小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAW264.7為被動(dòng)靶向細(xì)胞模型，人正常肝細(xì)胞LO2為主動(dòng)靶向細(xì)胞模型和人肝癌細(xì)胞HepG2為疾病細(xì)胞模型，采用激光共聚焦顯微鏡定性和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀定量研究三種細(xì)胞對(duì)不同脂質(zhì)磁性納米粒的攝取情況;采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（M

7、TT實(shí)驗(yàn)）考察不同的脂質(zhì)磁性納米粒分別對(duì)三種細(xì)胞的毒性;采用脂溶性DiR作為近紅外熒光染料，制備DiR標(biāo)記磁性脂質(zhì)納米粒，采用小動(dòng)物活體熒光成像儀觀察不同的脂質(zhì)磁性納米粒在正常裸鼠肝臟的分布。研究結(jié)果表明:RAW264.7細(xì)胞對(duì)SLN-USPIO的攝取強(qiáng)于Gal-SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG，LO2細(xì)胞對(duì)Gal-SLN-USPIO的攝取強(qiáng)于SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG，而HepG2細(xì)胞

8、對(duì)三種脂質(zhì)磁性納米粒的攝取無(wú)明顯差異性;LO2和HepG2兩種細(xì)胞共孵育競(jìng)爭(zhēng)性攝取實(shí)驗(yàn)表明，LO2細(xì)胞對(duì)Gal-SLN-USPIO的攝取明顯強(qiáng)于HepG2細(xì)胞對(duì)Gal-SLN-USPIO的攝取，這一研究結(jié)果為后續(xù)的在體肝癌模型分子成像及診斷提供了可能;三種脂質(zhì)磁性納米粒在濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，各種細(xì)胞的存活率均在80％以上，說(shuō)明本研究所制備的脂質(zhì)磁性納米粒具有較低的毒性，對(duì)臨床應(yīng)用具有可靠的安全性;在體肝臟分布研究結(jié)果表明，對(duì)肝臟

9、具有雙靶向功能的Gal-SLN-USPIO在不同時(shí)間點(diǎn)的肝臟分布均強(qiáng)于SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG對(duì)照組，該結(jié)果提示具有雙靶向功能的Gal-SLN-USPIO有望成為肝臟疾病診斷的磁共振造影劑。
　　第三部分:脂質(zhì)磁性納米粒的體外細(xì)胞MR成像研究
　　配制7管鐵濃度分別為0、1、10、15、25、50，100μg/ml的Gal-SLN-USPIO納米粒懸液，經(jīng)3.0T磁共振掃描儀獲得T2*WI圖像，

10、測(cè)定各管T2*弛豫時(shí)間，評(píng)價(jià)所制備的脂質(zhì)磁性納米粒Gal-SLN-USPIO的負(fù)性強(qiáng)化效果;分別對(duì)攝取三種不同脂質(zhì)磁性納米粒后的人正常肝細(xì)胞LO2和人肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行MR成像，以其信號(hào)強(qiáng)度的差異性分析不同脂質(zhì)磁性納米粒對(duì)LO2和HepG2兩種細(xì)胞的靶向攝取能力。研究結(jié)果表明，所制備的Gal-SLN-USPIO的T2*信號(hào)強(qiáng)度隨濃度的增加而減低;T2*時(shí)間測(cè)量結(jié)果顯示，隨著脂質(zhì)磁性納米粒濃度的增高，T2*時(shí)間逐漸縮短，說(shuō)明本研究所制

11、備的Gal-SLN-USPIO具有負(fù)性造影效果，并存在一定的濃度效應(yīng)關(guān)系，即在一定濃度范圍內(nèi)，Gal-SLN-USPIO濃度越高，其T2*WI負(fù)性強(qiáng)化效果越明顯;體外細(xì)胞MR成像研究結(jié)果表明，Gal-SLN-USPIO被LO2細(xì)胞攝取后，其信號(hào)強(qiáng)度降低最明顯，所對(duì)應(yīng)的R2*值明顯大于SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG組(p＜0.05);三種脂質(zhì)磁性納米粒被HepG2細(xì)胞攝取后，其對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度及R2*值三者之間無(wú)明顯

12、差異(p＞0.05)，這一研究結(jié)果也與之前的體外細(xì)胞攝取研究結(jié)果相吻合。以上結(jié)果提示以Gal-SLN-USPIO作為對(duì)比劑所構(gòu)建的MR探針具有應(yīng)用于體內(nèi)成像的可行性，為進(jìn)一步地體內(nèi)原位肝癌成像實(shí)驗(yàn)奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　第四部分:脂質(zhì)磁性納米粒的體內(nèi)MR分子成像研究
　　本研究采用肝癌組織塊原位移植法構(gòu)建HepG2裸鼠原位移植肝癌模型;將腫瘤模型隨機(jī)分為三組，每組裸鼠通過(guò)尾靜脈分別注射三種脂質(zhì)磁性納米粒（劑量約含鐵0.5μg

13、/g體重）后，采用小動(dòng)物線圈經(jīng)3.0T磁共振(MR)掃描獲得不同時(shí)間點(diǎn)的橫斷位T2WI圖像，測(cè)量增強(qiáng)前及增強(qiáng)后不同時(shí)間點(diǎn)每組的正常肝組織、腫瘤及背景噪聲的MR信號(hào)強(qiáng)度(SI)，計(jì)算肝臟組織與腫瘤的信噪比(SNR)、腫瘤-肝臟的對(duì)比信噪比(CNR)、每組增強(qiáng)前后之間及增強(qiáng)后三組間CNR的差異;磁共振掃描結(jié)束后處死裸鼠，切取含瘤肝臟組織做常規(guī)HE染色，以證實(shí)腫瘤模型構(gòu)建的成功與否;做普魯士藍(lán)染色，進(jìn)一步證實(shí)不同脂質(zhì)磁性納米粒在肝臟中的靶向性

14、分布情況。體內(nèi)MR成像的研究結(jié)果表明，三組裸鼠增強(qiáng)后不同時(shí)間點(diǎn)T2WI序列肝內(nèi)腫瘤的SNR較增強(qiáng)前均無(wú)顯著性差異(p＞0.05)，正常肝組織的SNR較增強(qiáng)前均有顯著性差異(p＜0.05)，增強(qiáng)后Gal-SLN-USPIO組腫瘤-肝臟的CNR較SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG組明顯提高且有顯著性差異(p＜0.05);病理切片HE染色結(jié)果表明，本研究所構(gòu)建的HepG2裸鼠原位移植肝癌模型全部接種成功;普魯士藍(lán)染色結(jié)果表

15、明，Gal-SLN-USPIO組正常肝臟組織中的藍(lán)色鐵顆粒明顯多于SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG組，進(jìn)一步證實(shí)了Gal-SLN-USPIO對(duì)肝臟的靶向性明顯強(qiáng)于SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG。以上研究結(jié)果提示Gal-SLN-USPIO有望成為肝臟靶向的特異性MR探針。
　　總結(jié)以上實(shí)驗(yàn)，本研究成功制備了對(duì)肝臟具有主被動(dòng)雙靶向功能的脂質(zhì)磁性納米粒Gal-SLN-USPIO，并通過(guò)體內(nèi)外