穩(wěn)定表達(dá)αvβ3細(xì)胞系的建立及其對(duì)口蹄疫病毒易感性的評(píng)價(jià).pdf

1、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)是單股正鏈RNA病毒，屬于微RNA病毒科口蹄疫病毒屬成員，F(xiàn)MDV對(duì)偶蹄動(dòng)物高度致病，包括牛、水牛、豬、山羊、綿羊及多種野生物種。病毒識(shí)別受體是病毒感染的第一步，決定著病毒感染細(xì)胞的類型和宿主嗜性。FMDV可以識(shí)別不同受體，然后介導(dǎo)不同的路徑進(jìn)入細(xì)胞。FMDV通過(guò)識(shí)別位點(diǎn)RGD結(jié)合整聯(lián)蛋白受體（αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8）后，通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)

2、吞路徑進(jìn)入細(xì)胞;FMDV還可以同VP3第56位精氨酸(VP3056R)結(jié)合硫酸乙酰肝素受體，通過(guò)小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞路徑進(jìn)入細(xì)胞。整聯(lián)蛋白受體除了介導(dǎo)病毒感染作用外，還具有介導(dǎo)或激發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種作用，這些功能參與病毒的致病機(jī)制還不清楚。因此，本研究為了揭示單個(gè)受體對(duì)病毒感染和信號(hào)介導(dǎo)的作用，構(gòu)建單個(gè)受體細(xì)胞系，為進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。本研究克隆了整聯(lián)蛋白受體αvβ3基因，并構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)αvβ3的CHO-677-αvβ3細(xì)胞系，并評(píng)價(jià)

3、了對(duì)口蹄疫病毒的易感性，具體內(nèi)容如下:
　　(1)αv和β3亞基的克隆:從乳鼠肺組織中分別提取了整聯(lián)蛋白受體αv和β3亞基基因組總RNA，根據(jù)GenBank中已公布的整聯(lián)蛋白αv和β3亞基基因序列，分別設(shè)計(jì)合成兩對(duì)特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增出鼠源整聯(lián)蛋白αv和β3亞基基因，產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后分別與pGEM-T載體相連，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并進(jìn)行多序列比對(duì)分析。結(jié)果表明，鼠源整聯(lián)蛋白αv亞基基因全長(zhǎng)3135bp，編碼1045個(gè)氨基酸，β

4、3亞基基因全長(zhǎng)2364bp，編碼788個(gè)氨基酸。序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，鼠源αv亞基基因與人、豬同源性較高，而β3亞基基因與牛和綿羊的同源性較高。
　　(2)αv和β3蛋白表達(dá)及其多抗的制備:將擴(kuò)增的αv和β3部分胞外域基因分別與原核表達(dá)載體pET-30a相連，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序確認(rèn)讀碼框正確后，將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白。通過(guò)SDS-PAGE鑒定后提取包涵體，以電泳分離純化的重組融合蛋白

5、免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，以Western blot鑒定血清特異性。結(jié)果顯示，實(shí)現(xiàn)了重組融合蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)，SDS-PAGE顯示分子量分別為40 kDa和40 kDa，主要以包涵體形式存在于菌體中，該血清可與目的蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　(3)穩(wěn)定表達(dá)αvβ3細(xì)胞系建立:用高效慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)αvβ3異二聚體的CHO-677細(xì)胞系，用PCR和IFA分別從基因和蛋白水平檢測(cè)了第二十代細(xì)胞系中

6、αv和β3亞基的表達(dá)，表明該基因已經(jīng)成功的導(dǎo)入CHO-677細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)。
　　(4)對(duì)口蹄疫病毒易感性的評(píng)價(jià):為了評(píng)價(jià)該細(xì)胞系對(duì)口蹄疫病毒易感性，用蝕斑實(shí)驗(yàn)、TCID50、實(shí)時(shí)熒光定量和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)比較分析口蹄疫病毒在細(xì)胞系和親本細(xì)胞上的生物學(xué)特性差異，結(jié)果表明感染FMDV/O/ZK/93之后，與親本細(xì)胞相比，CHO-677-αvβ3細(xì)胞系上病毒RNA水平和蛋白表達(dá)量顯著提高。數(shù)據(jù)表明成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)αvβ3的細(xì)胞系，并