應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制口蹄疫病毒的基因表達(dá)與復(fù)制的研究.pdf

1、口蹄疫（Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth DiseaseVirus，F(xiàn)MDV）引起的多種偶蹄動(dòng)物共患的急性傳染病，被國(guó)際獸疫局（OIE）列為A類傳染病之首。 FMDV基因組只有一個(gè)開(kāi)放的讀碼框，首先翻譯為一個(gè)多聚蛋白，經(jīng)過(guò)蛋白酶切割為成熟的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白。其中3C基因編碼一個(gè)巰基蛋白酶，它將FMDV的P12A前體切割成VP4，VP2，VP3和VP1四種結(jié)構(gòu)蛋白，

2、包裝成病毒的衣殼。因此3C在FMDV復(fù)制中具有非常重要的作用。RNA干擾（RNAi）現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的dsRNA引發(fā)的廣泛存在于動(dòng)植物中的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，小于30nt的siRNA分子可以誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的RNA干擾現(xiàn)象，抑制甚至關(guān)閉相應(yīng)靶基因的表達(dá)，被廣泛用于基因功能、遺傳病和感染性疾病的治療研究，取得了誘人的結(jié)果。FMDV的3C基因在FMDV不同血清型和亞型中非常保守，本研究針對(duì)3C基因開(kāi)展了siRNA的

3、研究，篩選到可以有效抑制FMDV復(fù)制的siRNA分子，現(xiàn)報(bào)告如下。 首先，本研究克隆了FMDV O型的3C和3D基因，在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)，并用純化的表達(dá)產(chǎn)物免疫家兔，制備了的多克隆抗體，為3C和3D基因表達(dá)與功能研究提供了有用工具。 我們?cè)敿?xì)比較了O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial七個(gè)血清型FMDV的3C基因序列，根據(jù)其高度保守區(qū)的序列和美國(guó)Ambion公司建議的siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成了

4、2個(gè)siRNA模板3C07和3C12，分別克隆到siRNA表達(dá)載體pSilencer 4.1-CMV neo的CMV啟動(dòng)子下游，構(gòu)建相應(yīng)的重組表達(dá)質(zhì)粒pSilencer-3C07和pSilencer-3C12。同時(shí)，從FMDV O型感染性克隆中通過(guò)PCR擴(kuò)增了3C基因，將3C基因克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N3中，按照讀碼框架與EGFP基因的5’端融合，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒p3C-EGFP。將pSilencer-3C07、pSilence

5、r-3C12和陰性對(duì)照質(zhì)粒pSilencer-NC分別與p3C-EGFP共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，3C07和3C12均能不同程度地抑制3C基因的表達(dá)，抑制效率分別為30.9％和60.5％，可見(jiàn)3C12比3C07對(duì)3C基因表達(dá)的抑制效率高。 進(jìn)一步將pSilencer-3C07、pSilencer-3C12和pSilencer-NC分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，24h后接種FMDV，接種46h后病