口蹄疫病毒基因植物表達載體的構(gòu)建及其對大豆的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗已成為目前研究的熱點.與傳統(tǒng)疫苗相比,植物源性疫苗具有安全、穩(wěn)定、高效和廉價等優(yōu)點.植物作為生產(chǎn)疫苗的載體可將抗原表達于植物的可食部位(例如種子和塊莖).當植物被食用或飼喂時,植物源性疫苗可激發(fā)保護性的黏膜免疫反應(yīng).隨著生物技術(shù)的不斷完善,植物生物反應(yīng)器將會成為疫苗生產(chǎn)的有效途徑,并部分替代傳統(tǒng)疫苗的生產(chǎn)方式.口蹄疫(Foot and Mouth Disease)是一種高發(fā)性流行傳染病,常在國際間大規(guī)模爆發(fā)

2、,目前尚無治愈本病的藥物,現(xiàn)在使用較廣泛的是酵母源性疫苗.因為酵母源性疫苗生產(chǎn)成本較高,貯運過程中需要低溫,注射接種需要特定設(shè)備而限制了它的應(yīng)用.利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)植物源性的口蹄疫疫苗前景廣闊.目前,口蹄疫病毒基因(FMDV)已經(jīng)導入馬鈴薯、煙草和苜蓿等植物,有關(guān)口蹄疫病毒基因?qū)氪蠖怪械难芯课匆妶蟮?根據(jù)口蹄疫病毒基因序列FP1(包括FVP1,實驗操作與FP1相同)設(shè)計引物,同時引入酶切位點BamHI和SaLI.通過PCR反應(yīng)從pGE

3、M-FP1載體上擴增FP1基因,并插入pUCM-T載體構(gòu)建成pUCM-FP1中間載體.PCR和酶切鑒定正確的克隆進行測序,序列分析結(jié)果表明,插入目標序列完全正確.用BamHI和SaLI同時酶切pUCM-FP1中間載體和植物組成型表達載體pBin438,構(gòu)建成植物表達載體pBin-FP1.熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109.經(jīng)過PCR和酶切鑒定正確的克隆轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101,成功構(gòu)建了2個載體,分別命名為pBin-FP1、pBin-FVP

4、1.用攜帶此表達載體的根癌農(nóng)桿菌GV3101侵染大豆.通過農(nóng)桿菌介導的大豆子葉節(jié)再生體系轉(zhuǎn)化大豆.采用從發(fā)芽5-7d的大豆無菌苗切取子葉節(jié)外植體,經(jīng)農(nóng)桿菌浸染和3d的共培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)移到芽誘導培養(yǎng)基上,10d后從子葉節(jié)處誘導出叢生芽.在含50μg/ml卡那霉素的伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后,抗性芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng),共得到51株卡那抗性植株.28株移栽成活的T<,0>代植株已正常開花和結(jié)莢,經(jīng)PCR檢測獲得目的基因的陽性植株15株.初步驗證了