樹突狀細胞加工滅活口蹄疫病毒抗原分子機制的研究.pdf

1、口蹄疫(foot and mouth disease， FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄動物的一種急性、烈性傳染病，但其免疫應答機制尚不清楚。適應性免疫應答的啟動需要樹突狀細胞(dendritic cell，DC)的抗原提呈，并且DC還能交叉提呈非復制性抗原，故被稱為機體最強火的抗原提呈細胞，但目前尚不清楚DC是否提呈FMDV抗原。 FMDV主要經消化道、呼吸道和皮膚感染機體，并可在咽部大量繁殖。因此，咽

2、部被認為是抗FMDV感染的重要器官。然而，目前不僅不清楚咽部粘膜組織在對口蹄疫病毒免疫應答中的作用，而且對牛咽部DC的分布情況也未見報道。本研究首先用免疫組織化學法對lO頭乳牛咽部及其引流淋巴結內的DC進行了觀察。結果發(fā)現(xiàn)，不僅咽部粘膜中有大量DC成群分布，引流淋巴結皮質中的濾泡DC和并指狀DC清晰可辨，而且在淋巴結髓質也有大量S-100+DC分布。為探明咽部DC是否參與FMDV抗原提呈，研究者模擬自然感染途徑給BALB/c小鼠口服接種

3、了FMD滅活疫苗，然后，比較不同時間內咽部引流淋巴結內DC的動力學變化。結果發(fā)現(xiàn)，口服FMDV滅活疫苗24h后，小鼠頸淺淋巴結內DCs數(shù)量就有增多，散在分布于皮質區(qū)，48h時后小鼠頸淺淋巴結內DCs數(shù)量明顯增多，并且主要分布于副皮質區(qū)，在72h后，咽部DCs向頸淺淋巴結副皮質區(qū)的遷移達到頂峰，至96h，頸淺淋巴結內DCs的數(shù)量急劇下降，在皮質區(qū)和副皮質區(qū)內呈現(xiàn)散在分布狀，然而，120h后，頸淺淋巴結內DCs數(shù)量再次增多，且主要分布于皮質

4、區(qū)。而PBSSt寸照組未見類似改變。同時，用ELISA法對口服接種FMD滅活疫苗不同時間的小鼠血清IFN-γ水平進行了檢測，結果顯示，接種疫苗24h后，小鼠血清內的IFN-γ,含量就開始升高，但與PBS對照組相比差異不顯著(P>0.05)，而48h后，接種疫苗組小鼠血清內的IFN-γ含量明顯升高，與PBS對照組相比，差異極顯著(P<0.01)。在接種72h后，接種疫苗組小鼠血清內的IFN-γ含量達到最高峰，與PBS對照組相比，差異極顯著

5、(P<0.01)。96h后，IFN-γ含量開始下降，與PBS對照組相比，差異顯著(P‘<0．05)，到120h時，與PBS對照組相比差異不顯著(P>0．05)。 以上結果表明，咽部DC就是FMDV抗原的提呈細胞，為了進一步研究DC提呈滅活FMDV抗原的分子機制，研究者首先制備了BALB/c小鼠的單核細胞源DC，并分別用免疫組織化學法和流式細胞術鑒定了DC。將FMD滅活疫苗荷載于DC，并進行細胞培養(yǎng)，然后在不同時間點用Wester

6、n blotting法做檢測DC內的泛素化蛋白。結果發(fā)現(xiàn)，在荷載滅活FMD疫苗0.5h后，DC內就出現(xiàn)了泛素化FMDV蛋白，分子量大約為75kD，3h后，泛素化蛋白含量稍有增加，但從不同時間點來看，泛素化蛋白含量變化趨勢不明顯。本試驗首次發(fā)現(xiàn)，將FMD滅活疫苗荷載于DC后，F(xiàn)MDV泛素化蛋白主要被FK2抗體標記，而FK1抗體標記的較少。這表明，滅活FMDV疫苗抗原在DC內既可在蛋白酶體的作用下降解出CD8+T細胞表位，又可在溶酶體內水解