丁型肝炎病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系的建立.pdf

1、丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）是一種類病毒樣核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）病毒，這種缺陷型病毒需要乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)提供乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)用于病毒的組裝、釋放和感染。與單獨的HBV感染相比，合并HDV感染后會加速肝硬化的程度，會增加暴發(fā)性肝炎和肝細(xì)胞癌的發(fā)生率。但是

2、目前關(guān)于HDV的研究還是相對缺乏，因此加強對HDV的進一步研究是非常必要的。
　　目前丁型肝炎病毒的獲取方式有兩種:一種是從丁型肝炎患者的血清中直接提取HDV，但我國丁型肝炎的患者比較少見，若想依賴從血清中直接提取HDV的這種途徑不現(xiàn)實;另外一種是基于質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HuH-7等細(xì)胞系的HDV包裝方法，但是當(dāng)研究需要大量病毒時工作量會明顯增大，而且實驗批次之間的可重復(fù)性也較差。最近廈門大學(xué)發(fā)表了基于腺病毒的HDV病毒包裝新方法，解決了

3、一定問題。但到目前為止尚沒有HDV的穩(wěn)定包裝細(xì)胞系用于HDV的大規(guī)模生產(chǎn)和抗病毒藥物評價。
　　HDV是HBV的衛(wèi)星病毒，為HBV感染的研究提供了替代工具。本研究欲構(gòu)建HDV復(fù)制包裝轉(zhuǎn)座子載體并嘗試轉(zhuǎn)染不同的肝癌細(xì)胞系，驗證各項HDV相關(guān)復(fù)制感染指標(biāo)，最終篩選出具有高包裝效率和高感染性的HDV單克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　本研究首先采用分子克隆方法構(gòu)建出含HDV復(fù)制子和HBsAg表達(dá)框的piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子載體并進行

4、了功能評價。將構(gòu)建好的載體瞬時轉(zhuǎn)染HuH-7細(xì)胞，通過檢測細(xì)胞上清HDV RNA和HBsAg的含量初步確定載體的功能完好，相關(guān)功能基因得到有效表達(dá)，并通過濃縮細(xì)胞上清病毒后感染HBV受體鈉離子/牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運蛋白(Na+/taurocholate Cotransporting Polypeptide，NTCP)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HepG2.N9確定了細(xì)胞上清含有感染性HDV顆粒。
　　課題組成員應(yīng)用該載體和其他HDV復(fù)制包裝載體系統(tǒng)

5、轉(zhuǎn)染了多個人來源肝癌細(xì)胞系，通過應(yīng)用嘌呤霉素快速大規(guī)模篩選最終獲得一株HDV的高包裝效率細(xì)胞系K7。本研究進一步通過化學(xué)發(fā)光法檢測細(xì)胞上清HBV表面抗原的含量，ELISA檢測細(xì)胞上清HBV preS1的水平，以及定量PCR檢測細(xì)胞上清HDV病毒滴度，利用HBV受體NTCP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HepG2.N9評價了細(xì)胞上清HDV病毒體外感染性，結(jié)果表明本研究成功建立了支持HDV復(fù)制、包裝、分泌的人源肝癌細(xì)胞系K7，其細(xì)胞上清可檢測到大量的HBs

6、Ag并可檢測到HBV preS1的存在，細(xì)胞上清HDV滴度達(dá)到1E+08GE/ml(GE，genome equivalents)以上，并且證明本細(xì)胞所分泌的HDV病毒體外具有較好的感染性。
　　本實驗通過構(gòu)建含有HDV復(fù)制子和HBsAg表達(dá)框的HDV表達(dá)載體，嘗試篩選不同來源的人肝癌細(xì)胞系，最終成功篩選出了具有較高包裝效率和感染性的HDV包裝分泌單克隆細(xì)胞系K7，解決了HDV大規(guī)模包裝生產(chǎn)的難題，并為大規(guī)模篩選潛在抗丁型肝炎分子藥