通城豬與大白豬豬肝羧酸酯酶表達(dá)譜與品種差異研究.pdf

1、豬肝羧酸酯酶(pig liver esterase，PLE)，屬于絲氨酸水解酶，是由多種同工酶組成的酶家族，各同工酶之間基因序列高度同源。由于在催化底物水解時具有高度的立體選擇性和高度酶活性，PLE成為有機(jī)化學(xué)合成領(lǐng)域水解酶的主角，而PLE作為藥物代謝酶角色的研究很少。本課題組前期研究結(jié)果提示:PLE主要成員之一PLE1可催化水解某些磺胺類藥物，PLE同工酶活性存在差異，不同品種豬PLE同工酶豐度存在差異。受PLE表現(xiàn)出的高度水解活性、

2、以及人羧酸酯酶的表達(dá)水平呈顯著年齡相關(guān)性且已成為臨床用藥依據(jù)事實的啟發(fā)，同時基于本課題的前期研究，系統(tǒng)比較研究不同品種和不同年齡豬PLE同工酶豐度和總表達(dá)量差異，可望為豬臨床合理用藥提供必要的理論依據(jù)。
　　本研究選取國家重點保護(hù)品種通城豬和外來優(yōu)良瘦肉型品種大白豬，進(jìn)行PLE的品種差異研究;參考研究人羧酸酯酶表達(dá)譜的年齡段，選取8日、1月、3月、成年（6～7月）四個年齡段豬，每個年齡段選取3頭三代以內(nèi)無血緣關(guān)系的豬進(jìn)行PLE表達(dá)

3、譜研究。由于PLE同工酶之間的基因和氨基酸序列高度同源，導(dǎo)致RT-qPCR和WB無法區(qū)分各自的mRNA和蛋白質(zhì)，因此，本研究先根據(jù)同工酶保守區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列，分別設(shè)計RT-qPCR通用引物和制備通用抗體，檢測PLE同工酶的mRNA和蛋白質(zhì)總表達(dá)水平，同時用通用底物p-NPA測定肝臟S9的水解活性;再通過對肝臟中PLE同工酶ORF的大量克隆、測序，獲得各同工酶出現(xiàn)的頻率。結(jié)合PLE同工酶的mRNA水平和各同工酶出現(xiàn)的頻率，得到各

4、PLE同工酶表達(dá)豐度的數(shù)據(jù)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　對1月齡和成年的兩個品種豬，首先用RT-qPCR檢測了11種組織中（分別是肝臟、心臟、脾臟、腎臟、肺臟、小腸、皮膚、肌肉、腦、淋巴結(jié)及胸腺）PLE同工酶mRNA總表達(dá)水平，結(jié)果表明無論年齡大小，PLE在兩種豬肝臟中表達(dá)量均為最高，其次為腎臟、小腸和皮膚。肝臟是機(jī)體內(nèi)主要的代謝解毒器官，同時PLE在肝臟中表達(dá)量也最高，因此，后續(xù)研究集中在豬肝臟中PLE上。
　　RT-q

5、PCR檢測四個年齡段的兩個品種豬肝臟中PLE同工酶mRNA總表達(dá)量。結(jié)果表明在通城豬和大白豬肝臟中PLE mRNA總表達(dá)量最高的年齡段分別是3月齡和1月齡，但總體上mRNA表達(dá)水平與年齡呈正相關(guān)。兩個品種豬相比，除3月齡時通城豬的PLE mRNA表達(dá)水平比大白豬高，其它三個年齡段都是大白豬比通城豬的高。
　　根據(jù)PLE同工酶靠近C末端的氨基酸保守序列設(shè)計合成兩種多肽段，即PLE-C1-1:SKEAAKKPPKIKC和PLE-C2:

6、CNTQAAKRLKGEE，兩種多肽鏈等量混合后與KLH偶聯(lián)，合成人工免疫原，免疫新西蘭大耳兔，獲得免疫血清，免疫血清用已偶聯(lián)前述兩種多肽的SulfoLink凝膠柱進(jìn)行免疫親和層析純化，得到效價高、特異性強的抗PLE通用抗體。等量混合同年齡段S9配制S9樣品，WB檢測S9樣品中PLE總蛋白量，用ImageJ讀取PLE和內(nèi)參GAPDH的灰度值，計算兩者的比值，得到四個年齡段通城豬和大白豬的比值依次是0.74，2.00，3.62，3.09和

7、1.30，3.86，2.89，3.82，表明通城豬和大白豬PLE總蛋白表達(dá)量最高的年齡段分別是3月齡和1月齡，但總體上PLE蛋白表達(dá)水平與年齡呈正相關(guān)。兩個品種豬相比，除3月齡時通城豬蛋白表達(dá)水平比大白豬高，其它的三個年齡段都是大白豬比通城豬高。PLE蛋白表達(dá)趨勢與mRNA一致。
　　在含1μmol/L p-NPA的PBS(50mM，pH7.2)反應(yīng)體系中，檢測肝臟S9樣品的催化水解活性，測得四個年齡段通城豬和大白豬的S9樣品比活

8、依次是:0.19U，0.59U，0.9U，1.29U和0.4U，1.05U，1.22U，1.69U。PLE酶活性表現(xiàn)出隨年齡增長而增強的趨勢，與PLE的mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)趨勢大體一致。兩個品種豬相比，四個年齡段大白豬的肝臟S9對p-NPA的水解活性都比通城豬強。
　　通過以上試驗獲得了PLE同工酶的總表達(dá)量，但無法獲得同工酶各自表達(dá)豐度的數(shù)據(jù)。克隆每頭豬肝臟中PLE同工酶各亞型的完整ORF。每頭豬隨機(jī)挑取至少20個陽性克隆進(jìn)行

9、測序，共測序800多個陽性克隆。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)共克隆到108種PLE亞型，除去5種已報道的亞型，發(fā)現(xiàn)103種新亞型，重復(fù)出現(xiàn)的PLE亞型有50多種，在2頭豬以上出現(xiàn)的有39種，其中有19種在兩個品種的豬中出現(xiàn)。將出現(xiàn)頻率高的54種亞型，按25個變異位點的氨基酸的相似度分為7大類(A～G)，每一大類再用阿拉伯?dāng)?shù)字區(qū)分。
　　統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)兩個品種豬肝臟中PLE同工酶表達(dá)豐度存在明顯差異，大白豬的四個年齡段都是PLE-A1表達(dá)豐度最高，其次是P

10、LE-B9;相反地，通城豬在前三個年齡段都是PLE-B9表達(dá)豐度最高，其次是PLE-A1（8日）或PLE-G5（1月和3月），而成年階段是PLE-G3表達(dá)豐度最高。還發(fā)現(xiàn)PLE-G5和PLE-G3分別在兩個品種豬的1月齡和成年期表達(dá)量大幅上升，提示PLE-G3和PLE-G5可能在兩個品種豬的生長和成年階段發(fā)揮重要作用。
　　本研究發(fā)現(xiàn)通城豬和大白豬肝臟中PLE存在顯著的品種差異，且其表達(dá)水平與年齡顯著相關(guān)，這將導(dǎo)致相同獸藥對不同年