家蠶羧酸酯酶基因Bmae33的克隆與外源表達(dá).pdf

1、羧酸酯酶是一類可以水解多種酯類化合物的多功能酶，廣泛分布于生物界，在生物體內(nèi)起著十分重要的作用。根據(jù)底物特異性及序列相似性，可將其分為α-酯酶，β-酯酶，乙酰膽堿酯酶，保幼激素酯酶，膠質(zhì)接觸蛋白，神經(jīng)趨化蛋白，神經(jīng)連接蛋白和Glutactin等8個(gè)亞家族。羧酸酯酶家族在生物體內(nèi)的功能高度分化，在外源物質(zhì)解毒，信息素降解，神經(jīng)/發(fā)育調(diào)控過(guò)程中都有十分重要的作用。過(guò)去的研究多以果蠅，蚊子等為模式生物，探討其在殺蟲劑解毒代謝中的作用與功能。<

2、br>　　 研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲成蟲觸角羧酸酯酶有降解酯類信息素以維持嗅覺系統(tǒng)靈敏性的功能。新近研究表明，觸角中的羧酸酯酶也有降解寄主植物酯類揮發(fā)性代謝物質(zhì)的作用，拓展了我們對(duì)觸角酯酶功能的認(rèn)識(shí)，暗示昆蟲嗅覺系統(tǒng)羧酸酯酶不僅能終止酯類物質(zhì)信號(hào)，也可能在嗅覺系統(tǒng)正常生理功能的維系中起重要作用。
　　 以往對(duì)鱗翅目昆蟲觸角酯酶的研究多集中于成蟲觸角酯酶對(duì)揮發(fā)性氣味物質(zhì)的降解，對(duì)幼蟲觸角酯酶的研究鮮有報(bào)道。為此，本文以家蠶為實(shí)驗(yàn)材料，選取

3、家蠶幼蟲嗅覺系統(tǒng)表達(dá)的酯酶Bmae33進(jìn)行了分析。主要結(jié)果如下：
　　 1.Bmae33基因去除信號(hào)肽序列后，設(shè)計(jì)添加限制性酶切位點(diǎn)的引物，對(duì)該基因進(jìn)行克隆，獲得了長(zhǎng)為1605bp的片段。
　　 2.Bmae33與其他昆蟲觸角酯酶或氣味物質(zhì)降解酯酶的多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)這些蛋白都具有羧酸酯酶活性必須的三個(gè)氨基酸殘基Ser，His和Glu，同時(shí)也包含α/β羧酸酯酶的特征性基序G1y-x-Ser-x-Gly，利用Raswin對(duì)該蛋

4、白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)這三個(gè)氨基酸殘基聚在一起，構(gòu)成催化三聯(lián)體。另外，系統(tǒng)發(fā)生樹分析顯示，家蠶Bmae33與多音天蠶氣味物質(zhì)降解酯酶 Apol-ODE及海灰翅夜蛾觸角酯酶Slit-EST可能為直系同源基因。
　　 3.RT-PCR分析表明：Bmae33基因在五齡三天家蠶幼蟲的頭、體壁和脂肪體等組織高表達(dá)，暗示該基因可能與外源物質(zhì)解毒和氣味物質(zhì)降解相關(guān)。另外，利用有機(jī)磷殺蟲劑辛硫磷熏蒸處理后發(fā)現(xiàn)，幼蟲頭及成蟲觸角中Bmae33基

5、因表達(dá)上調(diào)，暗示該酶對(duì)辛硫磷有降解作用。
　　 4.將所得Bmae33基因片段分別與原核表達(dá)載體pET-28a(+)及真核表達(dá)載體pPIC9K連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體Bmae33/pET-28a(+)與真核表達(dá)載體Bmae33/pPIC9K，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株及畢赤酵母X-33菌株中，分別用IPTG與甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)產(chǎn)物SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Bmae33在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)，

6、用帶His標(biāo)簽的鎳離子親和層析柱進(jìn)行純化，Western blotting鑒定蛋白純化情況，并用純化的蛋白免疫小鼠制備了多克隆抗體。
　　 5.為了獲得有活性的蛋白，對(duì)Bmae33基因的序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，利用重疊延伸PCR技術(shù)克隆優(yōu)化基因，并構(gòu)建畢赤酵母重組表達(dá)載體。
　　 本文對(duì)家蠶幼蟲嗅覺系統(tǒng)羧酸酯酶Bmae33進(jìn)行了一系列研究，成功制備了多克隆抗體；另外，為得到有活性的蛋白，對(duì)Bmae33基因進(jìn)行了序列優(yōu)化，并成