桑根黃酮降血糖效應及其作用機制研究.pdf

1、糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，與心腦血管疾病和腫瘤共同成為人類的“三大健康殺手”。目前，中國已成為糖尿病患者最多的國家，其中II型糖尿病約占發(fā)病率的95％以上，并呈現(xiàn)低齡化、病死率增多的快速增長趨勢。在自然界中，黃酮類化合物主要來源于植物的次生代謝產(chǎn)物，通常具有苯并色原酮的基本母核，已發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物達4000多種，其結構復雜多變，具有多種藥理活性，如抗氧化、抑制腫瘤細胞生長、降血糖、降血壓、抑菌和防治呼吸系統(tǒng)疾病等。黃酮類

2、化合物是桑根皮中的重要活性成分之一，具有降血糖作用，且效果顯著，但其作用機制尚不明確。因此，深入探討桑根皮黃酮類化合物降血糖的作用機制，可為開發(fā)良好的降血糖藥物提供重要的理論參考價值。本研究從桑根皮總黃酮的提取工藝出發(fā)，考察提取時間、乙醇體積濃度和原料質(zhì)量濃度三個對桑根皮總黃酮提取率影響較大的因素進行交互影響和分析；進一步對桑根皮提取物進行硅膠柱層析，分離純化，并利用HPLC對黃酮化合物進行分析，建立HPLC指紋圖譜；在此基礎上，對所得

3、的桑根皮不同部位和單體化合物進行體外酶抑制活性篩選；最后通過3T3-L1前脂肪細胞建立的胰島素抵抗模型探討桑根皮總黃酮的降血糖作用機制，為研制桑根皮總黃酮的降血糖藥物提供理論支持和技術參考。主要研究結果如下：
　　1、桑根皮總黃酮提取工藝優(yōu)化：選取塘10品種的桑根皮作為原材料，選取提取時間、乙醇體積濃度和原料質(zhì)量濃度作為單因素條件，利用超聲波輔助提取，以Box-Benhnken中心組合試驗設計法優(yōu)化提取工藝條件，桑根皮總黃酮得率為

4、響應值，建立回歸模型，采用Design-Expert軟件對實驗結果進行回歸分析，確定超聲波輔助提取桑根皮總黃酮最佳工藝條件為：提取時間1.66 h，原料質(zhì)量濃度0.04 g/mL，乙醇體積分數(shù)79.70%。實際操作時將其修正為提取時間1.6 h，原料質(zhì)量濃度0.04 g/mL，乙醇體積分數(shù)80.0%。采用此優(yōu)化的工藝條件提取桑根皮總黃酮的得率達到3.63%，預測值為3.71%。采用響應面分析法優(yōu)化桑根皮總黃酮的提取工藝條件具有較好的實際

5、應用價值，為桑根皮功能性成分的研究奠定了一定的原料基礎。
　　2、桑根皮提取分離及HPLC分析：利用硅膠柱層析、制備型HPLC等手段對桑根皮提取物進行分離純化，得到4個單體化合物，鑒定其為熊果酸、β-谷甾醇、桑根皮素和白樺脂酸；同時，對桑根皮總黃酮提取物進行極性分部萃取，分別得到石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相等不同極性部位，運用HPLC對桑根皮黃酮提取物進行指紋圖譜分析，比較分析桑根皮中黃酮單體含量，結果發(fā)現(xiàn)含量

6、最多的是山奈素，其次是桑根皮素和桑皮黃素，最少的是異槲皮苷和桑黃酮E。通過此部分實驗，為桑根皮黃酮HPLC指紋圖譜的研究奠定理論依據(jù)，也為后期體外酶活性篩選提供樣品。
　　3、體外降血糖活性評價：以桑根皮中得到的4個單體化合物和不同極性萃取部位為試驗樣品，綜合考察其體外α-葡萄糖苷酶抑制活性、蔗糖酶抑制活性、PTP1B酶抑制活性，以及DPPH自由基清除能力和FRAP體外抗氧化能力。結果表明，從桑根皮中所獲得的樣品對三種血糖相關酶均

7、有一定抑制作用，但抑制能力強弱存在差異。桑根皮黃酮粗提物、乙酸乙酯萃取相和桑根皮素抑制效果明顯，且同時對兩種酶（α-葡萄糖苷酶和 PTP1B酶）表現(xiàn)出顯著性抑制作用；而在抗氧化活性評價中，正丁醇萃取相同時表現(xiàn)出強的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力（FRAP），桑根皮粗提物和乙酸乙酯萃取相表現(xiàn)出較強的總抗氧化能力（FRAP）。
　　4、桑根黃酮降血糖作用機制初探：利用3T3-L1前脂肪細胞建立胰島素抵抗模型，考察桑根黃酮對脂肪細

8、胞增殖分化的影響，以及其對 PI3K-Akt信號通路中關鍵因子PPARγ、IR、PI3K、Akt、GLUT-4、PTP1B的基因表達和蛋白表達的調(diào)控作用。結果顯示，與模型組相比，桑根黃酮能改善3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗，上調(diào)PPARγ、IR、PI3K、Akt、GLUT-4基因表達水平，下調(diào)PTP1B基因表達水平，而對蛋白表達的影響并未與基因表達呈現(xiàn)一致性，推測可能與基因片段的內(nèi)含子與外顯子及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等因素有關。綜上所述，桑根黃酮降