分化抑制因子1(Id1)在胃癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是世界范圍尤其是亞洲地區(qū)較為常見(jiàn)的腫瘤。胃癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確，而Id1 在胃癌中的表達(dá)情況和作用未見(jiàn)報(bào)道。在本課題研究中，我們關(guān)注Id1 分子在胃癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用，并初步探討其機(jī)制，對(duì)胃癌腫瘤的發(fā)病機(jī)理的研究將有所幫助。 【目的】 1、研究Id1 在胃腺癌中的表達(dá)以及與臨床病理特征和臨床分期的關(guān)系，探討其在胃癌發(fā)生和進(jìn)展中的意義；2、觀察Id1 對(duì)胃癌細(xì)胞惡性表型的影響并探討可能的機(jī)制，篩選Id1 的下

2、游效應(yīng)分子；3、研究胃癌細(xì)胞中低氧條件或HIF-1 過(guò)表達(dá)時(shí)，Id1 的表達(dá)變化及調(diào)控機(jī)制。 【方法】 1、應(yīng)用免疫組化觀察Id1 在胃腺癌組織中的表達(dá)；2、應(yīng)用半定量RT-PCR方法和Western blot 技術(shù)，檢測(cè)Id1 蛋白在胃癌細(xì)胞系及組織中的表達(dá)以及Id1，Id2 和Id3 在胃癌細(xì)胞系中mRNA 水平的表達(dá)情況；3、通過(guò)基因重組方法構(gòu)建Id 的全長(zhǎng)載體、siRNA 載體；4、應(yīng)用MTT 實(shí)驗(yàn)、平板克隆、軟

3、瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)以及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)研究Id1 對(duì)胃粘膜永生化上皮細(xì)胞GES-1 體外增殖及體內(nèi)成瘤性的影響；5、應(yīng)用MTT 實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)，研究Id1 對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901 生長(zhǎng)、凋亡、侵襲和體內(nèi)成瘤能力的影響；6、通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖、管形成和體內(nèi)腫瘤微血管染色等實(shí)驗(yàn)研究Id1 的表達(dá)變化對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響和體內(nèi)新生血管密度的影響；7、ELISA 方法用于檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清中VEGF 的含量；8、通過(guò)

4、基因芯片技術(shù)篩選Id1 相關(guān)的差異表達(dá)基因，并應(yīng)用Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中部分下游分子如：p16、p21、TIMP4 的表達(dá)水平；9、在低氧培養(yǎng)條件下（1％O2）觀察SGC7901 細(xì)胞中Id1 的表達(dá)變化；10、應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，檢測(cè)在低氧條件下以及共轉(zhuǎn)染HIF-1 時(shí)，Id1 啟動(dòng)子活性的變化；11、應(yīng)用體外凝膠遷移（EMSA）和體內(nèi)染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，鑒定HIF-1 結(jié)合Id1 啟動(dòng)子的片

5、斷。 【結(jié)果】 1、Id1 在胃腺癌組織中表達(dá)升高 我們應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)Id1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在11例(11/15)胃腺癌手術(shù)組織標(biāo)本中，與其相應(yīng)的癌旁組織相比，Id1在蛋白水平的表達(dá)明顯增高；應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)Id1在99例胃腺癌病人手術(shù)標(biāo)本石蠟切片中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Id1主要表達(dá)于胃癌細(xì)胞的胞漿，僅少數(shù)表達(dá)于胞核。在正常胃粘膜上皮幾乎沒(méi)有表達(dá)，在10-30％腸化生伴有異型增生的細(xì)胞中有表達(dá)，染色

6、評(píng)分為0.33±0.09；進(jìn)一步分析Id1的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Id1在低分化胃腺癌（染色評(píng)分：1.4±0.45）明顯強(qiáng)于高分化胃腺癌中的表達(dá)（染色評(píng)分：0.66±0.12，p<0.05）。Id1在TNMⅢ期和Ⅳ期患者的胃腺癌組織中的染色明顯強(qiáng)于在Ⅰ期和Ⅱ期組織中的表達(dá)（p<0.05），染色評(píng)分分別為1.31±0.87和0.66±0.52。此結(jié)果提示，與癌旁胃粘膜上皮組織相比，胃腺癌組織中Id1的表達(dá)增高，且在低分化和TN

7、M晚期的患者中表達(dá)更高。 應(yīng)用半定量RT-PCR和Western blot的方法，檢測(cè)胃癌細(xì)胞SGC7901, AGS,MGC803, MKN45, MKN28, KATOⅢ及胃粘膜上皮永生化細(xì)胞系GES-中Id1，Id2和Id3三個(gè)基因mRNA的表達(dá)情況以及Id1蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常胃粘膜組織相比，胃上皮永生化細(xì)胞系GES-1及七種胃癌細(xì)胞系中Id1，Id2和Id3在mRNA水平表達(dá)增高；Id1蛋白在七種細(xì)胞系

8、中的表達(dá)也增高，且在低分化的細(xì)胞系中升高更為顯著。 2、Id1 外源性高表達(dá)于永生化胃粘膜上皮細(xì)胞可以促進(jìn)其增殖，Id1 的特異性小干擾RNA 可以降低胃癌細(xì)胞的惡性表型 我們構(gòu)建了Id1 的全長(zhǎng)表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了永生化胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1，發(fā)現(xiàn)Id1 的高表達(dá)能夠明顯促進(jìn)GES-1 在體外的增殖，并賦予其在軟瓊脂中生長(zhǎng)和形成克隆的能力。 我們將構(gòu)建好的siRNA 載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Id1 中等程度表達(dá)的胃癌S

9、GC7901 細(xì)胞，該siRNA 能顯著抑制SGC7901 中Id1 的表達(dá)（IdRNAi1 和IdRNAi2 克隆中Id1 的抑制率分別為60％和90％）。Id1RNAi 轉(zhuǎn)染導(dǎo)致：SGC7901 細(xì)胞體外增殖減慢，在平板和軟瓊脂上形成克隆的能力降低，裸鼠體內(nèi)成瘤性也降低，瘤體積明顯減小，生長(zhǎng)減緩；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示細(xì)胞阻滯于G1 期；Id1RNAi 的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染能夠使細(xì)胞凋亡增加，Hochest33258 和TUNEL 原位檢測(cè)成瘤組

10、織中凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞中Casepase3 的活性形式增加；細(xì)胞穿過(guò)附著基質(zhì)模仿物Matrigel 的Transwell 小室的能力下降；細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌型VEGF 的含量明顯降低，且該細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能抑制HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）的生長(zhǎng)和體外管狀形成，在裸鼠體內(nèi)成瘤組織中微血管密度也明顯下降。上述Id1RNAi 對(duì)胃癌細(xì)胞惡性表型的改變與Id1在細(xì)胞中的表達(dá)呈劑量依賴(lài)關(guān)系。上述結(jié)果提示，Id1 參與了胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡

11、及誘導(dǎo)血管生成等多種生物學(xué)行為的變化，且Id1 的表達(dá)水平反映了細(xì)胞的惡性程度。 經(jīng)過(guò)Trizol 法抽提SGC7901-Id1RNAi 和對(duì)照細(xì)胞的總RNA，通過(guò)瓊脂糖檢測(cè)和Lab-on-Chip 分析表明，所提取的RNA 無(wú)明顯降解，RNA 的質(zhì)和量符合基因芯片測(cè)定的要求。經(jīng)過(guò)RNA 純化、熒光探針的制備純化及定量、芯片雜交、圖像采集及數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化等步驟，發(fā)現(xiàn)芯片的雜交信號(hào)強(qiáng)度較高，片內(nèi)信號(hào)均一。以?xún)煞N細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度的比值小于0

12、.5 或者大于2 為標(biāo)準(zhǔn)判定差異表達(dá)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照細(xì)胞相比，SGC7901/Id1RNAi 細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)的基因有1551 個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有70 個(gè)。我們對(duì)其中的差異分子進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在SGC7901-Id1RNAi 細(xì)胞中p16, p21 的表達(dá)被上調(diào)，TIMP4的表達(dá)上調(diào)，提示這些分子可能是Id1 發(fā)揮作用的下游分子。 3、在低氧條件下HIF-1 與Id1 啟動(dòng)子5’端-924 位點(diǎn)結(jié)合并促進(jìn)Id1 在胃癌細(xì)胞中

13、的表達(dá) 我們觀察到，在低氧條件下Id1mRNA 和蛋白水平表達(dá)均增加，而這種變化在HIF-1 被抑制后消失。提示Id1 可能是一個(gè)低氧反應(yīng)并能被HIF-1 誘導(dǎo)的基因。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)(http://dbtss.hgc.jp/)，Id1 啟動(dòng)子區(qū)域（-3000~+100）含有8 個(gè)HBS（HIF-1 Binding Site），并且第6（-924）和7（-910）個(gè)HBS 都緊鄰有CACAG 序列，這個(gè)序列對(duì)于HIF 與HBS

14、 的結(jié)合具有重要的輔助功能。我們克隆了不同長(zhǎng)度的Id1 啟動(dòng)子（分別命名為PM 和PS），PM 包含了第6，7 和8 個(gè)潛在HBS，PS 僅包含第8 個(gè)HBS。將PM 和PS克隆入PGL-3 basic 報(bào)告基因載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SGC7901 細(xì)胞。在低氧（1％O2）誘導(dǎo)或共轉(zhuǎn)染HIF-1 質(zhì)粒時(shí)，可以檢測(cè)到PM 的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。我們針對(duì)這些潛在的HBS 位點(diǎn)設(shè)計(jì)了探針和引物，應(yīng)用體外EMSA（Electrophoresismobilit

15、y shift assay）和體內(nèi)ChIP（chromosome immunoprecipitation）檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結(jié)合的方法，檢測(cè)這些潛在的HBS 與HIF-1 的結(jié)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1 能夠結(jié)合于第6 個(gè)（5’端-924 位點(diǎn)）HBS，突變探針中的3 個(gè)核苷酸（CGT），這種結(jié)合能力則喪失。本實(shí)驗(yàn)提示，HIF-1 能與Id1 的啟動(dòng)子結(jié)合，在-3000~+100 啟動(dòng)子范圍內(nèi)，5’端-924 位點(diǎn)處的HBS（5’-GA