鎘脅迫及MTF1對(duì)斑馬魚id1基因的調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、為了研究鎘脅迫及金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子MTF1（metal transcription factor1）對(duì)斑馬魚（Danio rerio）id1基因的影響和調(diào)節(jié)機(jī)制，本碩士學(xué)位論文分別利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR、重組質(zhì)粒的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，探索了可能發(fā)生的部分調(diào)節(jié)機(jī)制；同時(shí)，通過斑馬魚胚胎注射和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的方法，對(duì) id1啟動(dòng)子活性的整體情況及體內(nèi)外活性的變化進(jìn)行了研究。具體內(nèi)容如下：
　　1.鎘脅迫斑馬魚后i

2、d1基因及mtf基因表達(dá)量變化分別使用0、1/25和1/5LC50鎘對(duì)斑馬魚進(jìn)行脅迫，4天后對(duì)存活斑馬魚對(duì)照組及鎘處理組的肝臟、鰓、腸道、脾臟及腎臟分別取材，提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)各組織中 id1、mtf1及 mtf2的表達(dá)量變化分別進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，鎘脅迫斑馬魚96 h后，在肝臟組織中，三個(gè)基因表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著性上調(diào)：id1在高濃度組顯著性上調(diào)，mtf1和mtf2在低濃度組中分別極顯著和顯著上調(diào)；

3、在鰓組織中，id1表達(dá)量在高濃度組極顯著升高，在低濃度組有上升趨勢(shì)，但沒有顯著性變化。mtf1在低濃度組顯著性下調(diào)，高濃度組又呈現(xiàn)上調(diào)，與對(duì)照組基本持平。mtf2與mtf1變化趨勢(shì)相同，但與對(duì)照組相比沒有顯著性差異；在腸、脾臟、腎臟組織中，三個(gè)基因表達(dá)量在鎘脅迫后均呈現(xiàn)出低濃度組逐漸上升，高濃度組先升后降的趨勢(shì)，但均沒有顯著性變化。
　　2.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)體外研究MTF1對(duì)id1基因的調(diào)節(jié)機(jī)制因MTF1在其他物種中研究較多，且

4、已被廣泛認(rèn)定為是應(yīng)答金屬脅迫的主要因子。而 MTF2研究較少且功能不確定。因此，本論文只研究了MTF1對(duì)id1的作用。通過生物信息學(xué)方法對(duì)id1基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)，在id1啟動(dòng)子上5’端翻譯起始位點(diǎn)之前約3kb片段中，存在7個(gè)MRE（金屬應(yīng)答調(diào)節(jié)元件）位點(diǎn)，并將其以距離ATG位置最近起始，分別命名為MRE1-7；之后，使用半巢式PCR及引物突變PCR的方法構(gòu)建了一系列質(zhì)粒，包括斑馬魚id1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒（ID1-2.8k-P

5、GL3）以及各MRE位點(diǎn)單點(diǎn)突變質(zhì)粒（mMRE1-7PGL-3）、MTF1轉(zhuǎn)錄因子真核表達(dá)質(zhì)粒（MTF1-pcDNA3.1）及其突變體質(zhì)粒 dnMTF1-pcDNA3.1。通過質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染鯉魚上皮瘤（EPC）細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)MTF1轉(zhuǎn)錄因子（野生型及突變型）對(duì)斑馬魚id1啟動(dòng)子（野生型及突變型）活性變化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， MTF1對(duì)id1啟動(dòng)子的活性影響存在濃度依賴性，表現(xiàn)出低促高抑的趨勢(shì)，id1啟動(dòng)子上7個(gè)MRE位點(diǎn)對(duì)

6、id1啟動(dòng)子活性的作用存在差異，MRE3、MRE7對(duì)id1啟動(dòng)子活性具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，MRE1、MRE5對(duì)id1啟動(dòng)子活性具有正調(diào)節(jié)作用。
　　3.斑馬魚id1啟動(dòng)子體內(nèi)外活性分析通過構(gòu)建斑馬魚id1啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，分別以EPC細(xì)胞和斑馬魚胚胎為材料進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)染和體內(nèi)注射，并采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)不同長(zhǎng)度斑馬魚id1啟動(dòng)子在體內(nèi)、外的活性情況進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，不同長(zhǎng)度id1啟動(dòng)子活性，在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)

7、出隨著啟動(dòng)子長(zhǎng)度變化而變化的情況。同時(shí)，啟動(dòng)子活性變化趨勢(shì)在體內(nèi)和體外并不一致，呈現(xiàn)較大差異性。
　　從研究結(jié)果得出如下結(jié)論：
　　1.鎘對(duì)斑馬魚的脅迫可以促進(jìn)肝臟和鰓中id1基因及MTF1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化，表明id1基因和mtf基因在鎘脅迫機(jī)體的應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在各組織中不同的變化表明，鎘脅迫后各組織的應(yīng)激反應(yīng)有所差異，且id1基因及mtf基因的表達(dá)具有組織差異性。在肝臟中，id1基因及mtf基因同時(shí)上調(diào)表

8、明，id1基因的上調(diào)或許和mtf基因的高表達(dá)相關(guān)。
　　2.雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)表明，id1基因可能部分受到MTF1因子的調(diào)節(jié)，并且MTF1對(duì)id1基因的影響呈現(xiàn)低促高抑的趨勢(shì)。對(duì)id1啟動(dòng)子上金屬應(yīng)答元件（MRE）的突變實(shí)驗(yàn)表明，各MRE元件對(duì)id1啟動(dòng)子活性的貢獻(xiàn)不同。
　　3.斑馬魚id1啟動(dòng)子體內(nèi)外活性分析結(jié)果表明，id1啟動(dòng)子活性隨長(zhǎng)度變化不同表現(xiàn)各異，說明啟動(dòng)子上存在眾多順式調(diào)控元件。體內(nèi)外活性趨勢(shì)的差異表明，